结核分枝杆菌及结核疫苗新作用方式的研究

2023-09-18 02:45王瑞欢李马超李桂莲刘海灿万康林

中国人兽共患病学报 2023年8期

王瑞欢,李马超,李桂莲,刘海灿,万康林

结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的传染性疾病,也是引起世界人口死亡的主要原因之一。据报道,全球四分之一的人口感染Mtb,大部分感染的人群表现为潜伏感染的状态,在感染的人群中,其中约5%～10%的人口可能发展为活动性肺结核。世界卫生组织(WHO)报告,2021年全球约有1 060万人罹患结核病,其中160万人死于结核病(包括同时感染HIV的人群)[1]。在新型冠状病毒(COVID-19)大流行之前,结核病是排在艾滋病毒/艾滋病之上的由单一传染病引起的主要死因,目前为止依然是导致死亡的主要致死性传染病[2]。

机体的感染结果取决于宿主和病原菌之间相互作用的过程。由于Mtb致病机理较为复杂,目前机体抗Mtb感染的免疫机制以及Mtb的逃逸机制尚不完全清楚。卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)作为唯一被批准应用的预防性疫苗,其可预防婴幼儿罹患重症结核病,但对青少年和成人的保护作用存在巨大差异[3]。长期以来,人们对结核疫苗的研发目标是刺激机体产生更强的Th1型免疫应答,但最近研究发现仅诱导产生高水平的IFN-γ并不能提供全面的保护效果[4]。Mtb作为胞内寄生菌,在感染人体后细胞免疫发挥重要作用,但其免疫方式复杂且机制尚不明确,新型疫苗研发刻不容缓[5]。因此,本文重点阐明机体的细胞免疫应答过程、Mtb抑制抗原提呈和逃逸T细胞免疫的机制,以及结核疫苗的研发进展。

1 机体抗结核的免疫反应以及作用机制

结核分枝杆菌经呼吸道感染之后,肺部的先天性免疫细胞通过模式识别受体对Mtb表面的病原相关分子模式(PAMP)进行识别,介导Mtb进入细胞,免疫细胞通过吞噬、自噬和凋亡等反应杀伤病原菌,发挥最早的免疫防御作用[6]。先天免疫对早期抗结核反应至关重要,同时激发适应性免疫应答,产生的杀伤效应和记忆效应可发挥长期免疫作用。适应性免疫激发的途径首先是巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell, DC)通过MHC分子对抗原提呈,T细胞通过抗原受体TCR识别抗原并被激活。MHC-Ⅱ将外源性抗原肽呈递给CD4+T细胞,被活化的CD4+T细胞分化为不同的亚群,其中Th1和Th17亚型是介导保护效应的主要细胞亚群[7]。其中,Th1型细胞通过分泌INF-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子,进一步激活巨噬细胞,以有效杀灭Mtb[8]。Th17型细胞通过分泌IL-17等细胞因子,招募中性粒细胞至Mtb感染小鼠的肺部,以吞噬和清除Mtb[9-10]。MHC-Ⅰ类分子将内源性抗原肽呈递给CD8+T细胞,被活化的效应性CTL细胞到达炎症部位,主要通过细胞毒作用杀伤含Mtb的巨噬细胞[11-12]。尽管有来自于宿主细胞的压力,Mtb依然进化出多种免疫逃逸机制使其在宿主体内持续存活,包括阻碍吞噬体的成熟和自噬、抑制抗菌肽的形成、遏制宿主细胞凋亡和阻断抗原提呈等,并且通过形成标志性病变肉芽肿在体内持续存在[13]。Mtb表面的糖脂可破坏三磷酸磷脂酰肌醇分子(PI3P),阻止吞噬溶酶体的形成[14];Mtb分泌的磷酸酶(SapM和PtpA)和丝氨酸/苏氨酸激酶(PknG)可干扰吞噬体的成熟,逃避宿主溶酶体的降解[15];Mtb还可通过ESX-1分泌系统介导的吞噬体逃逸躲避机体对Mtb的降解和杀伤,包括主要早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)破坏吞噬体,CFP-10改变细胞信号通路,下调炎症反应等途径发挥逃逸作用[16-18]。

巨噬细胞表面的多种模式识别受体能够识别Mtb表面及其组分,不同的细胞表面受体通过信号传导激发或抑制下游系列的免疫应答,受体成分主要包括C型凝集素、补体受体、清道夫受体、Fc受体和Toll样受体(TLR)等[19-20]。其中,TLR是重要的固有免疫受体,通过识别Mtb上表达的多种不同的PAMP,激活下游相关通路引发免疫反应,也是连接固有免疫和特异性免疫的桥梁。通过调控TLR信号通路发挥免疫功能的方式主要如下:TLR2、TLR4主要识别菌体表面的脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA),TLR3主要识别Poly(I∶C)促进较强的细胞毒性T淋巴细胞反应,TLR9识别DNA中未甲基化的CpG[21]。大多数TLR配体具有活化树突状细胞的功能,TLR被激活后,可通过与MyD88结合,激活NF-kB信号通路,发挥抗菌活性;并可通过产生IFN-γ等细胞因子,上调免疫细胞的抗原提呈能力,有效激活T细胞。已有研究证明在人巨噬细胞中,TLR通过激活上调维生素D受体和维生素D-1-羟化酶基因的表达,诱导抗菌肽导管素的生成和杀死细胞内的Mtb[22]。目前由葛兰素史克公司研发的单磷酰脂A(MPL,MPL可以激活TLR4受体)和氢氧化铝组成的佐剂AS04,于2009年通过FDA的批准上市应用于宫颈癌疫苗中[23]。由Dynavax公司研发的CpG佐剂,于2017年被FDA批准应用于HBV疫苗[24];同时CpG佐剂应用于结核亚单位疫苗GamTBvac,其临床Ⅰ期的实验中显示出较好的免疫原性[25]。另外,由葛兰素史克公司研发的M72/AS01E新型结核疫苗在的临床Ⅱ期的结果中显示,其对结核病感染的控制作用为50%,其成为目前具有较大应用潜力的结核疫苗。M72/AS01E中的混合佐剂由皂素、MPL组成,其中MPL作为模式识别受体的配体通过增强抗原提呈能力,提高抗原的免疫原性[26]。另外,目前进入临床试验的其它3种蛋白亚单位疫苗ID93+GLA-SE和H56/IC31,使用的佐剂均为TLR受体激动剂,在临床实验中表现出良好的保护效果[27]。目前,结核亚单位疫苗研究最为广泛的新型佐剂包括脂质体和TLRs激动剂,其通过与重组蛋白抗原共同免疫接种,提高亚单位蛋白疫苗的免疫效力。

2 结核分枝杆菌抑制抗原提呈细胞的机制

由于Mtb感染专业的抗原提呈细胞,细菌的理想逃逸点是扰乱这些细胞的功能,其中一个靶点是减少抗原呈递细胞(APC)的MHC分子和共刺激分子的表达,这将直接影响T细胞的激活[28]。树突状细胞作为功能最强的APC,是体内唯一可以激活静息状态T细胞的一类细胞,在先天免疫和适应性免疫中都起着重要的作用[29]。在人体内,大部分的DC处于未成熟的状态,低表达共刺激分子和黏附分子,具有较强的吞噬抗原能力,但激发T淋巴细胞的能力较弱。未成熟的DC在吞噬抗原之后分化为高表达MHC分子、共刺激分子和黏附分子的成熟DC,并迁移到次级淋巴器官,通过识别活化针对该抗原的T细胞,激发适应性免疫应答。DC的成熟和活化是决定其是否能发挥有效免疫的重要因素[30]。然而,诸多研究证明宿主在感染Mtb之后,DC的成熟度受到了抑制,表现为低表达MHC和共刺激分子,使其不能有效的提呈抗原,从而导致免疫耐受[31-32]。树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3非整合素分子(DC-SIGN)是DC表面的一种新型凝集素受体,其与TB的发生密切相关,封闭DC-SIGN分子有助于恢复宿主抗结核免疫应答[33]。研究表明,Mtb细胞壁甘露糖修饰的脂阿拉伯糖(ManLAM)可与DC-SIGN相互作用抑制DC的活化,Mtb中的一些分泌蛋白也可能使DC-SIGN高表达,干扰DC的成熟[34-35]。因此,在结核疫苗抗原的筛选过程中应避免导致DC-SIGN过度增高的复杂抗原。

IFN-γ是激活巨噬细胞的重要细胞因子,对控制Mtb感染至关重要。在小鼠体内,IFN-γ基因敲除的小鼠由于易受到结核杆菌的感染而迅速死亡[36]。但仅产生IFN-γ却无法刺激巨噬细胞杀死Mtb,研究发现,可能由于感染Mtb的细胞阻断了巨噬细胞对IFN-γ的反应,具体表现为阻断II型反式激活蛋白的诱导以抑制MHC-II的表达[37]。Mtb和BCG都存在相同的逃避吞噬体成熟、自噬,减少MHC-II表达可能影响T细胞激活的机制。研究人员通过将激活TLR2的CFP-10的C5肽与Ag85B一起在BCG中过量表达组成BCG85C5,发现BCG85C5通过抑制降解MHC-II的MARCH1泛素连接酶,来增强吞噬细胞表面MHC-II的表达,并且在体外诱导MHC-II依赖性抗原呈递给CD4+T细胞,诱导产生更多的Th1细胞因子(IL-12、IL-1β和TNF-α)[38]。在MHC-II的组装和运输过程中,II类不变链由组织蛋白酶S处理,然后占据MHC-II肽结合槽,以保持稳定性。Mtb可通过诱导产生IL-10,降低组织蛋白酶S的表达,从而干扰MHC-II的合成[39]。虽然IL-10抑制组织蛋白酶S生成,干扰不变链合成的结论尚未在体内直接的验证,但研究发现IL-10缺陷的小鼠在感染结核分枝杆菌后,CD4+T细胞反应增强,同时肺部的细菌负担降低,这可能支持了这一机制的相关性[40]。

尽管宿主感染Mtb之后,会出现针对细菌抗原特异性的CD4+T细胞,然而通常依然会造成持续或慢性感染,主要原因是Mtb抑制了抗原呈递给CD4+T细胞[19]。通过比较感染Mtb和BCG巴斯德株的细胞对Ag85B特异性CD4+T细胞的反应,发现在Mtb和BCG感染之后,尽管Mtb感染之后产生的Ag85B较多,但Mtb感染之后,抗原提呈细胞激活Ag85B特异性CD4+T细胞的效果却不如BCG感染的细胞。相比于Mtb感染,BCG感染的Ag85B特异性CD4+T细胞激活仅需要更少的DC和细菌,这些数据表明,免疫细胞在被Mtb感染之后其抗原提呈能力下降,导致细菌在体内持续感染,证实了Mtb通过抑制抗原提呈和CD4+T细胞激活来逃避CD4+T细胞对细菌消除的机制[41]。

3 结核分枝杆菌逃逸T细胞免疫的机制

在控制Mtb方面,T细胞起着关键性的作用[42]。人们通过对由HIV引起的CD4+T细胞耗竭对结核分枝杆菌易感性的研究,证明了CD4+T细胞在结核病预防中的作用,所以CD4+T细胞也成为结核疫苗研究中需要关注的主要免疫细胞[43]。然而,在疫苗的研发过程中,却发现有诱导产生CD4+T细胞但未能提供有效保护的现象,所以决定T细胞保护能力的主要因素可能不是产生CD4+T细胞的数量,而是激活CD4+T细胞的特异性抗原性质。TB的保护性免疫不仅需要产生有效的T细胞,并且需要运输到受感染的组织部位,才能发挥免疫杀伤功能。即使抗原特异性T细胞是通过疫苗接种产生的,如果它们没有被抗原识别激活,也不会发挥其保护效应。重组BCG疫苗和亚单位疫苗研发的核心在于抗原的选择,然而,如何选择保护性较强的有效抗原,需要深入了解Mtb如何利用特定的免疫反应来减弱有益的T细胞反应。

结核分枝杆菌在整个感染的过程中,Mtb的许多抗原被CD4+T细胞识别,每个抗原在感染的不同阶段受到不同的调节,先前的研究表明,许多候选疫苗中包含的Mtb免疫优势抗原,如Ag85A、Ag85B和ESAT-6,表现出不同的表达模式,所以也导致了T细胞对这些抗原识别的能力不同[44]。据报道,小鼠在气溶胶感染细菌后大约3周后下调抗原Ag85B的表达,这可能是由于到达肺部的Mtb特异性CD4+T细胞反应对其施加了免疫压力,导致该抗原在以后的时间点上很难被识别[45]。另外,有学者通过将针对Ag85B和ESAT-6的特异性抗原CD4+T细胞转移到小鼠体内,通过分析其动力学功能,发现识别两种Mtb抗原的CD4+T细胞控制Mtb感染的能力都受到了限制,但其原因相反。在感染Mtb的前几周,Ag85B特异性T细胞数量增加,但在感染的1到2个月之后出现了缩减,虽然形成了分泌多种细胞因子的多功能性记忆T细胞,但保护能力却因Ag85B抗原的低表达而受到限制。相反,ESAT-6的表达和T细胞对其抗原的识别和加工在整个感染阶段是持续的,由于受到抗原的持续性刺激,小鼠体内一直保持了大量的效应细胞,其在感染Mtb之后也未能减少细菌量[44, 46]。又有研究发现,被Mtb持续刺激产生的ESAT-6特异性CD4+T细胞对其抗原表位的再刺激没有反应,这可能由于ESAT-6的特异性CD4+T细胞在Mtb的小鼠体内发生了功能性的耗竭,限制了其杀伤Mtb的功能[47]。所以,即便抗原刺激产生了免疫优势抗原特异性的CD4+T细胞,可能依然无法持续性控制Mtb的感染。这可能部分解释了为什么进入临床试验的基于病毒载体的MVA85A新型结核疫苗,在接种之后虽然产生了特异性的CD4+T细胞,却没有足够的保护作用,主要原因可能是该疫苗仅包含一种抗原,并且该抗原在Mtb感染期间呈现低表达的状态[48-49]。同样,发现含有ESAT-6的疫苗在给予结核潜伏感染(Latent Tuberculosis Infection,LTBI)受试者时,虽然诱导产生了抗原特异性CD4+T细胞,但却没有发挥较好的保护作用[44]。这一结果表明对已经感染LTBI的人接种疫苗,如果扩大单一的功能不良的抗原特异性T细胞,可能达不到较优的保护效果。这也提示我们在设计针对LTBI或活动性结核病患者的结核病疫苗的过程中,应避免只选择单一的抗原,对Mtb感染不同阶段的多组分免疫优势抗原混合应用可能更有意义。

4 结核疫苗的最新研究进展

截至到2022年9月,全球有16种新型结核候选疫苗正在进行临床试验,包括4种处于临床试验的第Ⅰ阶段,8种处于第Ⅱ阶段,4种处于第Ⅲ阶段[1](图1)。这些候选疫苗可分为4类:(ⅰ)亚单位蛋白/佐剂疫苗:用于暴露前和暴露后的预防或加强疫苗[50];(ⅱ)病毒载体疫苗:作为加强免疫疫苗以提高BCG的免疫效果[51-53];(ⅲ)减毒活疫苗或重组BCG:其主要作为暴露前预防性疫苗,旨在替代新生儿BCG的接种,同时目前也正作为成人暴露后疫苗被评估[50];(ⅳ)灭活的全菌疫苗:主要应用于暴露后的人群治疗和免疫调节。

图1 结核疫苗抗原在临床试验中的示意图[53]Fig.1 Schematic of TB vaccine antigens in clinical trials[53]

4.1 亚单位蛋白/佐剂疫苗亚单位蛋白疫苗的抗原成分较为明确,安全性较高,但其包含的抗原数量有限,单独免疫的效果较差。因此,需要与佐剂联合应用,佐剂旨在最大限度地提高疫苗中抗原的免疫效果增强其免疫原性,同时降低所需抗原剂量[54]。目前正在进入临床期的亚单位蛋白/佐剂疫苗包含:①M72/AS01E:由葛兰素公司研发的以AS01E为佐剂,包含MTB32A和MTB39A两种抗原的M72/AS01E目前是进展最快、最有希望被广泛应用的疫苗。M72/AS01E已在南非、肯尼亚和赞比亚等多地完成了临床Ⅱ期试验,经过3年的随访,结果显示,在18～50岁感染人群中的HIV阴性的Mtb潜伏感染者中,该疫苗对活动性肺结核发的保护率为54%[55-56]。②H56/IC31:多阶段疫苗H56/IC31以IC31(TLR9激动剂)为佐剂,由早期分泌抗原Ag85B、ESAT-6和潜伏感染抗原 Rv2660c组成。临床结果显示,该疫苗可诱导产生同时分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的多功能性抗原特异性的CD4+T细胞。此外,也有研究证明了其对多耐药结核病的治疗潜力[57]。③ID93/GLA-SE:以吡喃葡萄糖脂(glucopyranosyl lipid adjuvant formulated stableemulsion,GLA-SE)为佐剂,融合Rv2608、Rv3619、Rv3620和Rv1813蛋白的ID93/GLA-SE疫苗,临床Ⅱ期结果显示,其具有较高的安全性,且可诱导产生高水平的抗体和抗原特异性的多功能CD4+T细胞,主要用于BCG 初免后的加强免疫或者治疗结核病感染[58]。④AEC/BC02:以明矾和CpG混合物为佐剂,包含Ag85b和EAST6-CFP10蛋白的AEC/BC02疫苗是目前我国进入临床试验的结核疫苗,其主要用于预防Mtb潜伏感染人群结核病的发病,目前正在进行临床Ⅱ期试验(NCT05284812)。⑤Gam TBvac:以融合葡聚糖的CpG ODN(TLR9激动剂)为佐剂,包含Ag85A和ESAT6-CFP10多阶段抗原的Gam TBvac主要作为BCG初免之后的加强疫苗,目前正处于Ⅲ期试验阶段[59]。

4.2 病毒载体疫苗以病毒为载体的疫苗能够模拟病原菌入侵感染机体的过程,其主要以痘苗载体和腺病毒载体为主。改良后的载体本身不具有复制性,但可稳定表达外源基因,其本身安全性较高且具有佐剂效用[60]。目前正在进入临床期的病毒载体疫苗包含:①ChAdOx1 85A/MVA85A:以改良型安卡拉牛痘病毒为载体,表达Ag85A抗原的MVA85A疫苗于2004年首次在健康成人中进入Ⅰ期临床试验,其可诱导具有保护效应的T细胞免疫反应。但在Ⅱ期临床实验中,其作为加免疫苗不能提高BCG的保护效果,这可能和距离BCG初免的时间间隔太短有关[61-63]。为了避免人体内预存腺病毒抗体的影响,研究人员研发的基于黑猩猩腺病毒载体,表达Ag85A抗原的ChAdOx1 85A疫苗,在小鼠体内验证了其作为BCG初免之后的加强疫苗,提供比BCG单独使用更优的保护效果。同时,ChAdOx1 85A单独使用或和MVA85A联合应用于接种过BCG的健康人群,在人体内验证了其安全性和免疫原性,目前已经完成I期临床试验[64]。②TB/Flu04L:基于减毒的复制缺陷型流感病毒,表达结核分枝杆菌Ag85A和ESAT-6抗原的TB/Flu04L 疫苗在I期临床试验的结果表明,其经鼻腔或舌下给药,对接种BCG的健康成人具有较好的安全性和免疫原性(NCT03017378, NCT02501421)。③Ad5 Ag85A:以复制缺陷5型人腺病毒为载体,表达Ag85A抗原的Ad5 Ag85A,在接种过BCG的健康人群中,其经呼吸道途径和肌肉注射的途径免疫,证明该疫苗在人体内安全性,且比BCG更有效地刺激多功能T细胞反应[65]。

4.3 重组BCG或减毒活疫苗以BCG为载体,导入Mtb免疫优势抗原基因构建的重组BCG,其主要作为暴露前预防性疫苗,旨在替代新生儿BCG的接种。近年来,重组BCG也被作为成人暴露后疫苗应用,以防止结核病复发。减毒活疫苗是在Mtb的基础上,敲除毒力基因,其同样具有较好的免疫原性,主要作为预防性疫苗应用。与其他类型疫苗相比,重组BCG或减毒活疫苗的抗原成分较多,诱导的免疫反应更接近于自然状态的感染,产生的免疫反应更广泛且持久。①VPM1002(BCGΔureC::hly):VPM1002是在BCG的基础上增加了穿孔李斯特菌溶素(Hly)基因,使Mtb更易从吞噬体中释放,具有增加抗原提呈的功效;同时敲除了尿素酶C基因,以提供适应hly活性的酸性pH条件。该疫苗可启动交叉免疫反应,提供比BCG更优的保护效果[66]。②MTBVAC:是在结核杆菌Mt103的基础上敲除phoP (Rv0757)和fadD26 (Rv2930)两个毒力基因构建的减毒株疫苗。迄今为止,MTBVAC是唯一一个进入人体临床试验的Mtb减毒活疫苗,已经在成人和新生儿中完成I期和Ⅱ期临床试验,其结果显示比BCG更安全和有效,目前正在结核病流行国家的婴儿中进行Ⅲ期的疗效试验 (NCT04975178)[67]。

4.4 灭活疫苗基于分枝杆菌或非结核分枝杆菌裂解提取物制成的灭活疫苗,安全性较高,又可诱导广泛的免疫应答,主要作为暴露前预防和暴露后调节应用,其中RUTI、DAR-901和MIP目前处于临床试验阶段。①RUTI:由Mtb细胞壁裂解制成的RUTI疫苗,目前主要作为治疗性疫苗与抗生素治疗联合使用。Ⅰ/Ⅱ期临床试验证明了该疫苗在LTBI人群中的安全性、耐受性、免疫原性和有效性(NCT04919239、NCT02711735、NCT05136833)。②Mycobacteriumindicuspranii(MIP):MIP是一种介于快速生长和慢速生长之间的分枝杆菌,最初是为了麻风病的免疫治疗而开发,但临床试验同样显示了其对结核病的保护证据[68]。在临床前研究中,MIP在豚鼠和小鼠模型中表现出比BCG更高的免疫原性和预防性,具体表现为MIP诱导高水平的Th1和Th17细胞因子[69]。同时,在Ⅲ期临床试验中,MIP作为BCG的加强疫苗,增强了BCG的免疫应答,也被证实了其在预防结核病方面的潜在应用[70]。MIP疫苗在临床试验中也显示出对Mtb感染人群潜在的免疫治疗和预防作用,目前已进入Ⅲ期临床试验阶段[68]。③DAR-901:DAR-901是一种全细胞灭活非结核分枝杆菌疫苗。在Ⅱ期临床试验中,其应用于接种过BCG的青少年,诱导产生更高水平的多功能CD4+T细胞和增强的ESAT-6特异性免疫应答,显示出其在预防结核病感染方面的安全性和有效性[71-72]。

5 总结

人们对结核分枝杆菌感染免疫和发病机制的了解不断深入,也为结核疫苗的研发提供了理论依据。近年的研究表明结核亚单位蛋白疫苗具有较高的安全性和有效性,发展较为迅速,但该类疫苗对佐剂要求较高。由于结核分枝杆菌为胞内菌,宿主发挥有效的免疫反应首先需要对抗原提呈以激活T细胞,抗原提呈细胞表面有丰富的模式识别受体,因此选择针对这些受体的配体作为佐剂将是较优的选择。另外,由于结核分枝杆菌基因组本身的复杂性,导致其在进入人体之后呈现不同的感染状态,单一类型的结核疫苗较难消除所有人群中的结核病,因此疫苗的研发应选择包含不同组分的多种抗原,以实现全面免疫预防和治疗的目的。

利益冲突:无