基于线粒体12S rRNA基因对大理州亚洲带绦虫遗传多样性的分析

尹雪宇,陈远腾,庄尔俊,赵俊杰,董 玲,李海龙,2

带绦虫是一种肠道寄生蠕虫,人因生食含有囊尾蚴的猪肉或牛肉而感染[1],人体感染带绦虫病后通常无明显症状,少数患者会出现腹痛、腹泻、消化不良和食欲不振等不典型症状[2],感染人类的带绦虫主要有猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫。在我国带绦虫主要分布于云南、西藏以及四川等少数民族地区。云南大理是白族聚集地区, 当地居民喜食生皮(以生猪肉或猪肝为主),是导致带绦虫病流行的主要原因,近年有研究证实云南大理流行的带绦虫以亚洲带绦虫为主[3]。报告显示带绦虫在大理州各地感染程度不同,大理市感染率最高为87.29%,洱源县其次占6.08%,其余周边地区带绦虫感染率相对较低[4]。近年有学者对弥渡县带绦虫流行分布情况进行调查,结果显示弥渡县人群带绦虫感染率为15.7%,虫种均为亚洲带绦虫[5]。

12S rRNA是一种存在于线粒体核糖体中的小亚基RNA,进化速率较高[6],常用于各种脊椎动物的亲缘关系比较中[7-8],研究表明12S rRNA基因也可以用于猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫的分类鉴定[9]。因此,本研究基于线粒体12S rRNA基因序列对大理州5个地区的带绦虫群体进行遗传多样性分析,旨在为大理州带绦虫病的防控和研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 以大理州血吸虫防治所2019年5月至2021年8月收治的带绦虫患者为研究对象,采用槟榔—南瓜子—甘露醇法对患者进行驱虫[10],收集到131份亚洲带绦虫样本,对采集到的亚洲带绦虫样本进行分类,其中大理市(DL)58份、巍山县(WS)14份、弥渡县(MD)18份、漾濞县(YB)24份、洱源县(EY)17份。各样本来源地的地理分布情况如图1所示。

[审图号:GS(2022)1873号]图1 大理州5个亚洲带绦虫群体地理分布Fig.1 Geographical distribution of 5 populations of Taenia asiatica in Dali Prefecture

1.2 试剂与仪器 组织DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)、2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化有限公司)、DL2000 DNA Maker(TaKaRa大连宝生生物工程有限公司)、双蒸水、 DNA凝胶电泳成像系统(美国UVA公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取和引物设计 取下绦虫孕节并将其剪碎,用研磨器研磨后,按照组织DNA提取试剂盒说明书提取DNA,存放于4 ℃冰箱内。参考文献报道[11]对线粒体12S rRNA基因进行PCR引物设计,上游引物:5′-AGGGGATAGGACACAGTGCCAGC-3′;下游引物:5′-CGGTGTGTACATGAGCTAAAC-3′。

1.3.2 PCR扩增体系和程序 PCR扩增总反应体系为30 μL,其中2×Taq PCR MasterMix 15 μL,上游引物和下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL,双蒸水11 μL。反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35个循环,72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR产物检测和测序 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,于凝胶电泳成像系统中观察结果,将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行单向测序,测序引物与扩增引物相同。

1.3.4 序列分析 通过MEGA7.0软件对测序产物进行比对对齐,在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对;将经同源性比对为亚洲带绦虫的序列按地区进行分组整合;通过DNASP5.10.01软件对序列进行遗传多样性分析、中性检验分析以及遗传分化系数FST和基因流Nm分析(公式为Nm=(1/FST-1)/4)[12];通过MEGA7.0计算各组之间的碱基组成、变异位点数以及遗传距离。

2 结 果

2.1 PCR扩增结果 131条带绦虫12S rRNA基因的PCR扩增结果如图2所示(部分结果),长度为493 bp。测序产物经GenBank数据库中的BLAST同源性比对,131条带绦虫样本均确定为亚洲带绦虫,与NCBI中亚洲带绦虫12S rRNA基因序列(编号:MT448955)比对,同源性为:97.67%～100%。

注:M:DNAMaker 2000;1～8:部分阳性样品,目的片段493 bp。图2 部分亚洲带绦虫样本12S rRNA基因PCR电泳图Fig.2 PCR amplification of 12S rRNA from part of Taenia asiatica samples

2.2 碱基组成 通过MEGA7.0分析得到的亚洲带绦虫线粒体12S rRNA基因片段碱基组成如表1所示,A、T、G、C的平均含量分别为28.3%、43.2%、19.4%和9.1%,A+T含量(71.5%)明显高于G+C含量(28.5%),呈现A/T偏倚性。

表1 亚洲带绦虫各群体12S rRNA基因片段碱基组成Tab.1 Base composition of 12S rRNA gene fragment in different populations of Taenia asiatica

2.3 遗传多样性及变异 5个群体12S rRNA基因序列共检测到138个变异位点,共定义76个单倍体型。其中单倍型多样性为0.983 0,核酸多样性为0.033 2,呈现出高Hd高Pi的分布模式(Hd>0.5, Pi>0.005)。各群体中大理市的单倍型数最多为45,弥渡县的单倍型数最少为13。巍山群体的变异位点数最多为93,漾濞群体的变异位点数最少为25。巍山群体的单倍型多样性和核酸多样性最高,分别为1和0.054 9;弥渡群体的单倍型多样性最低,为0.966 7,漾濞群体的核苷酸多样性最低,为0.026 9;对各群体12S rRNA基因进行中性检验,其中大理市和巍山县的Fu’s Fs和Tajima’s D分别为显著负值,推测这两个群体可能曾发生过群体扩张(表2)。

表2 基于12S rRNA基因的亚洲带绦虫群体遗传多样性Tab.2 Genetic diversity of Taenia asiatica populations based on 12S rRNA gene

2.4 遗传分化系数(FST)与基因流(Nm) 运用DNASP软件计算亚洲带绦虫群体间的遗传分化系数。基于12S rRNA基因分析结果显示(表3),各群体之间的遗传分化指数范围为-0.019 13～0.040 80,除了巍山群体与各群体间有极小的遗传分化(01),其中以漾濞群体与巍山群体之间的基因交流最为频繁,Nm为22.497 95。

表3 基于12S rRNA基因的亚洲带绦虫群体遗传分化系数与基因流Tab.3 FST and Nm of Taenia asiatica population based on 12S rRNA gene

2.5 遗传距离 各群体12S rRNA基因经MEGA7.0计算得到的遗传距离结果见表4, 大理市与巍山县群体之间的遗传距离最大为0.022 9,漾濞县与洱源县群体之间的遗传距离最小为0.002 3;其中巍山群体与各群体间均具有较高的遗传距离(0.020 0～0.022 9),该群体与各群体间的亲缘关系相对较远。推测与各地区亚洲带绦虫群体进化速度不同有关。

表4 基于12S rRNA基因的亚洲带绦虫群体遗传距离Tab.4 Genetic distance of Taenia asiatica based on 12S rRNA gene

3 讨 论

本研究通过PCR扩增获得5个亚洲带绦虫群体的12S rRNA基因,结果显示12S rRNA基因序列的碱基组成呈A/T偏倚性,与蠕虫线粒体基因组成特点相吻合[13];单倍型多样性和核酸多样性是衡量一个物种或群体遗传多样性的重要指标,单倍型多样性和核苷酸多样性分别以0.5和0.005为界,数值越大说明遗传多样性越高[14]。在本研究中,12S rRNA的单倍型多样性和核酸多样性分别为0.983 0(Hd>0.5)和0.033 2(Pi>0.005),说明这5个群体均经过了长时间的演化[15],遗传多样性较高。

FST和Nm[17]是反应群体进化的两个重要参数。FST值的范围在0～1之间有意义,若00.25,表示两群体间有极大的遗传分化;若FST值为负,表示两群体间不存在遗传分化[18];Nm以1为临界值,数值越大则群体间基因流动交流越频繁且发生遗传漂流的概率越小[19]。本研究中,大理州5个群体的遗传分化指数为-0.019 13～0.040 80,其中巍山群体与其他群体之间的FST范围为0.010 99～0.040 80,说明巍山群体与各群体之间存在极小的遗传分化,其余4个群体之间的FST均为负值,说明这4个亚洲带绦虫群体间没有遗传分化;基因流范围5.877 45～22.497 95,说明各群体间基因交流水平较高。

群体间的遗传距离是衡量群体间的亲缘关系的指标,遗传距离越大,亲缘关系越远[20]。本研究中大理与巍山群体之间的遗传距离最大,漾濞与洱源群体之间的遗传距离最小,说明漾濞县和洱源县亚洲带绦虫群体之间存在较近的亲缘关系,巍山群体与各群体间的亲缘关系相对较远;Fu’s Fs[21]或Tajima’s D[22]值是中性检验的两个重要参数,可以推算种群的历史动态,当Fu’s Fs或Tajima’s D结果为显著负值,则表明群体出现过种群扩张效应;当Fu’s Fs或Tajima’s D结果不显著或接近于0时,说明该群体大小稳定,符合中性检验。这5个群体中大理群体和巍山群体的Fu’s Fs和Tajima’s D分别为显著负值,说明大理市和巍山县的亚洲带绦虫群体可能发生过群体扩张,这两个群体在某个时期的感染率可能升高。

本研究中亚洲带绦虫群体遗传分化程度较低,但均经过了长久的历史演化,遗传多样性较高。本研究对大理州亚洲带绦虫群体12S rRNA基因序列进行了测定和分析,评估亚洲带绦虫群体的遗传多样性,为亚洲带绦虫的遗传多样性研究提供了相关数据。

利益冲突:无

引用本文格式:基于线粒体12S rRNA基因对大理州亚洲带绦虫遗传多样性的分析[J].中国人兽共患病学报,2023,39(8):784-788. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.086