miR-19a 过表达对口腔鳞癌细胞CAL27 增殖和迁移的影响及其机制研究

马诞骅，陈吉俊，石宇远，范佳燕，高红燕，田柳，王梁

口腔鳞状细胞癌（OSCC）简称口腔鳞癌，约占口腔恶性肿瘤的90%，统计发现60%的OSCC 患者在确诊时已是晚期，常规治疗效果不佳[1]。因此，深入研究OSCC的发病机制不仅有利于早期癌变指标的确认和筛查，更有助于提高患者的生存率。miRNA是由内源基因编码的小非编码核糖核苷酸序列，一般由17 ～22 个核苷酸组成。在OSCC 研究中可以发现，miRNA 可参与调节OSCC 细胞的多种生物学行为，如增殖、凋亡、细胞周期阻滞、侵袭、转移，进而影响肿瘤的发生及发展[2]。有研究表明，miR-19a 与多种癌症发病密切相关[3]，但目前关于miR-19a 在OSCC 中的表达及其调控机制的研究甚少。本研究旨在探讨miR-19a 对OSCC 细胞增殖、迁移能力的作用及调控机制，为临床治疗提供新的思路及依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞与试剂 CAL27（口腔鳞癌细胞系，购自美国ATCC）；DMEM 培养基（美国Gbico 公司）；青霉素-链霉素（美国Gbico 公司）；miR-19a 模拟物（mimic）和对照随机（购自上海吉玛制药公司）；Lipofectamine3000 等转染试剂（购自美国Invitrogen 公司）；PCR逆转录试剂盒和试剂（购自Takara公司）；Western blotting 用一抗：-actin、GRK6 和PKC（购于美国abcam公司）；二抗（购自美国Santa Cruz公司）；BCA试剂盒（购于中国碧云天公司）。

1.2 细胞培养和转染 CAL27 细胞培养基：10%胎牛血清、1%链霉素、青霉素。培养箱条件为37 ℃，将处于对数生长期的CAL27 细胞，胰酶消化，收集并计数细胞，于转染前24 h以每孔5×105的细胞密度接种于6 孔板中，加入500l 无双抗新鲜高糖DMEM 培养基，细胞均匀铺板后放在37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养过夜，次日观察细胞生长情况，待细胞达到30%～50%融合度进行转染。将培养皿分为miR-19a mimic 组、阴性对照组和空白对照组。用DEPC 水配制成终浓度为50 nmol 的模拟物/阴性对照物，置于—80 ℃保存。分别用500l opti-MEM 稀释20l模拟物或阴性对照物，500l opti-MEM 稀释20l Lipofectamine 3 000 L，混匀后加入细胞孵育6 h，然后更换培养基。空白对照组中不滴加转染复合物。

1.3 miRNA 提取和RT-PCR 使用E.Z.N.A.micro-RNA isolation kit 提取细胞中miRNA，严格遵照试剂盒说明书操作，将纯化后的RNA 保存于—80 ℃备用。采用HiScript ⅡReverse Transcriptase kit 合成cDNA，反应体系为20l，反应条件：42 ℃3 min，60 ℃15 min，85℃5 min。以cDNA 为模板，利用ChamQ Universal SYBR qRCR Master Mix 进行qPCR，反应体系为20l，反应条件：95 ℃2 min，40个循环的60 ℃5 s、95 ℃10 s。以-actin 为内参，进行电泳显影，最后通过Image J对条带的灰度值进行分析统计，引物见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.4 细胞活力检测 采用MTT 法检测细胞活力，用胰蛋白酶消化细胞后，按细胞浓度1×104/ml接种；分别于12、24、48 及72 h 后终止细胞培养，PBS 清洗后各组加入100l 常规培养基，20l MTT 溶液，孵育4 h 后吸掉液体，加入150l 二甲基亚砜溶液，混匀静置，490 nm 波长处测定吸光度值。

1.5 细胞划痕实验 用胰酶消化CAL27 细胞，重悬，计数，以1×105/ml 接种于6 孔板中，待细胞融合后进行划痕处理，分别于0、12、24 h 后在40 倍镜下观察划痕愈合情况。Image J 测算迁移面积，计算划痕愈合率，公式：划痕愈合率（%）=（初始划痕面积—12 h/24 h 后划痕面积）/初始划痕面积×100%。

1.6 蛋白免疫印迹法 采用蛋白免疫印迹法检测GRK6、PKC 含量。用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，确定电泳上样量。电泳转膜后，4 ℃环境下用5%脱脂奶粉封闭过夜。第2 天用TBST 洗膜3 次后，加入一抗，4 ℃环境下孵育过夜。第3 天再用TBST 洗膜3次，加入相应的二抗，孵育1 h 后进行洗膜、显影，最后通过Image J 对条带的灰度值进行分析统计。

1.7 统计方法 采用Graphpad prism 软件进行分析，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用t 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 法验证miR-19a mimic 转染效率

miR-19a mimic 转染组细胞内miR-19a mRNA 水平高于阴性对照组（P ＜0.05），而阴性对照组与空白对照组miR-19a mRNA 表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05），该结果表明转染成功，可进行下一步实验，见图1。

图1 转染后各组细胞miR-19a mRNA 表达水平变化

2.2 转染miR-19a mimic 后对CAL27 细胞增殖能力的影响 培养48 及72h 后，miR-19a mimic 组细胞活力与阴性对照组差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见图2。

图2 miR-19a 对CAL27 细胞增殖的影响

2.3 miR-19a对CAL27 细胞迁移能力的影响 划痕处理12 h 后，miR-19a mimic 组与空白对照组细胞迁移差异无统计学意义（P ＞0.05），划痕处理24 h 后，miR-19a mimic 组CAL27 细胞的迁移数多于空白对照组（P ＜0.05），见图3。

图3 miR-19a 对CAL27 细胞迁移能力的影响

2.4 miR-19a 对CAL27 细胞中PKC、GRK6 蛋白活性的影响 miR-19a mimic 组与阴性对照组相比，CAL27 细胞中的GRK6 蛋白含量降低（P ＜0.05）；阴性对照组与空白对照组GRK6 蛋白水平差异无统计学意义（P ＞0.05）。miR-19a mimic 组与阴性对照组相比，PKC蛋白水平升高（P＜0.05），阴性对照组与空白对照组PKC 蛋白水平差异无统计学意义（P ＞0.05），见图4。

图4 miR-19a 对CAL27 细胞中GRK6、PKC 蛋白水平的影响

3 讨论

miRNA 被认为是转录后水平上基因表达的关键调节因子。近年来，越来越多的研究证明miRNA在OSCC 的发生及发展过程中发挥重要作用，被认为是OSCC 早期临床诊断和治疗的重要途径[4]。有研究发现，miR-19a 通过靶向调控TGFBR3，促进舌鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化和迁移[5]。在其他非口腔癌症研究中也发现miR-19a 具有促癌作用。Wu等[6]研究发现，miR-19a 通过调节TIMP-2 表达参与喉鳞状细胞癌的发生及发展。Calabrese 等[7]研究证明，miR-19a 在未分化甲状腺癌细胞中呈现过表达，且参与了未分化甲状腺癌细胞恶化。Liu 等[8]研究发现，miR-19a通过靶向调控TIA1，促进结直肠癌细胞增殖扩散。Feng 等[9]研究发现，miR-19a 作为促癌因子参与膀胱癌的发生。以上研究均表明，miR-19a 在多种肿瘤细胞中过表达并发挥促癌作用，增强肿瘤细胞的增殖及迁移水平。

本研究通过在CAL27 细胞中转染miR-19a mimics，提高细胞中miR-19a 表达水平，探究miR-19a 在OSCC中的作用。结果显示miR-19a能够促进CAL27细胞增殖与迁移。此外，本研究发现miR-19a 促进CAL27 细胞增殖与迁移作用可能与GRK6 有关。G蛋白偶联受体激酶（GRKs）是一种多功能蛋白激酶家族，其通过磷酸化G 蛋白偶联受体（GPCRs）细胞质环和尾部的特定丝氨酸/苏氨酸残基，催化GPCRs失敏。正常生理情况下GPCRs 通过激活PKA 和PKC进而调节机体各项生理功能[10]。GRK6、GRK4 和GRK5 同属于GRK4 亚族，广泛分布于全身并参与多种疾病进程[11]。Zhang 等[11]研究发现，通过siRNA 技术抑制MM1R 细胞中GRK6 活性，可促进细胞凋亡。Qiu 等[12]在对下咽鳞状细胞癌进行研究中发现，GRK6 明显降低，且GRK6 表达降低与下咽鳞状细胞癌细胞转移密切相关。Yao 等[13]研究表明，GRK6表达水平降低与肺腺癌细胞的迁移和侵袭密切相关。以上研究表明，GRK6 表达下调会促进癌细胞的增殖和迁移。本研究发现miR-19a 过表达导致CAL27 细胞的GRK6 表达明显减少，提示miR-19a的过表达诱导的细胞增殖和迁移可能与GRK6 下调相关，同时GRK6 是否为miR-19a 的下游靶基因也仍需通过进一步的靶向结合实验来证明。

PKC 是GPCRs 下游蛋白激酶，GPCRs 可通过激活PKC，介导细胞增殖和迁移，调节细胞凋亡等生理功能。在OSCC 相关研究中有报道指出，PKC 抑制剂十字孢碱通过促进P120ctn 和E-cad 蛋白表达，从而抑制癌细胞的增殖和迁移[14]。Tsai 等[15]研究显示，PKC 抑制剂可以通过抑制OSCC 细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）活性，从而抑制肿瘤形成。本研究发现，miR-19a 过表达导致CAL27 细胞的PKC 表达显著升高，提示miR-19a的过表达诱导的细胞增殖和迁移，其机制可能与GRK6 介导的PKC 表达变化有关。

本研究首先证实了miR-19a 能促进OSCC 的增殖和迁移，其机制可能与GRK6 介导的PKC 通路有关，通过下调GRK6 表达，提高PKC活性，进而诱导癌细胞的增殖及迁移。后续实验将证明GRK6 是否为miR-19a的下游靶基因，进一步通过沉默miR-19a技术来验证miR-19a 对OSCC 的作用，更深入研究GRK6-PKC 机制介导的下游细胞凋亡及增殖通路，更全面研究miR-19a 在OSCC 病程发展中的作用，为OSCC 的miRNA 靶向治疗提供理论基础。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 马诞骅：实验设计、实验操作、数据分析、论文撰写；陈吉俊、石宇远：实验试剂材料准备、文献检索、实验操作；范佳燕、高红燕、田柳：数据整理、统计学分析；王梁：研究指导、论文修改、经费支持