外周血BDNF、miR-132 及NfL对遗忘型轻度认知障碍患者向阿尔茨海默病转化的风险预测价值

张金娜，颜蓉

阿尔茨海默病（AD）相关症状具有隐匿性与进展性的特点，约33.7%的老年人在认知正常阶段，已经存在AD 相关病理改变[1]。因此，早期诊断与干预对改善预后具有重要意义。轻度认知障碍（MCI）是痴呆前认知障碍症状存在期，该时期可早于痴呆发病10 ～20 年[2]，患者通常表现为主观认知功能下降，但客观认知、日常生活及社会功能相对完善。现阶段较为成熟的进行性神经损伤检测方式为脑脊液生物标志物检测（诸如A 蛋白、Tau 蛋白）与影像学检测（PET 或MRI 等），其多具有侵入性，且成本较高。本研究评价外周血脑源性神经营养因子（BDNF）、mi-RNA132（miR-132）及神经丝轻链蛋白（NfL）水平对aMCI患者向AD转化的风险预测价值，旨在为早发现，早诊断，早期系统、正规及全面干预提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本选取

1.1.1 样本量预估 本研究中以认知损害不同阶段，即“aMCI 或AD”作为因变量，以患者人口学特征、疾病与健康因素、影像学改变、外周血分子生物学指标和神经心理评估共5 个方面16 项指标作为自变量，根据二元Logistic 回归样本量EPV 法则的相关要求[3]，再考虑5%的样本删失率，最终得到样本168 例，可满足回归分析统计需求。

1.1.2 样本采集 选取2018 年6 月至2022 年9 月绍兴市第七人民医院神经内科确诊的AD 与aMCI患者共182 例，剔除依从性低及研究资料不全样本9例，最终得到样本173 例。其中AD 组患者90 例，包括男38 例，女52 例；年龄56 ～78 岁，中位年龄67.00（62.50，70.50）岁。aMCI 患者83 例，包括男42 例，女41 例；年龄46 ～76 岁，平均64.00（58.00，68.00）岁。本研究经绍兴市第七人民医院伦理委员会审批通过。

1.1.3 纳入及排除标准 纳入标准：（1）AD诊断，参考《精神和行为障碍分类》（ICD-10）中AD的诊断标准[4]；（2）aMCI诊断，采取记忆域心理测评，分别包括听觉词语学习测验及延迟检测（AVLT 与AVLT-R）、逻辑记忆检测及延迟检测（LMT 和LMT-R）、Stroop色词测验（SCWT）、符号数字模式测验、波士顿命名测验（BNT）等，如患者具备两项评分均低于年龄矫正均值的1 个标准差（SD），则判断为aMCI[5]；（3）患者知情同意，主动参与。排除标准：（1）患有其他类型的痴呆患者；（2）具备语言域和执行域认知功能减低现象，但记忆域测试评分不符合aMCI 评估标准的MCI 患者；（3）合并颅内其他器质性病变或重要器官、系统病变患者；（4）存在其他神经精神障碍患者；（5）合并影响本研究外周血分子生物学指标水平的病变患者；（6）无法提供完整的研究相关数据或依从性欠佳者；（7）非知情同意者。

1.2 方法

1.2.1 外周血分子生物学指标检测 采集患者入院第2 天晨起空腹静脉血3 ml×2 个抗凝管。1 号管4 ℃恒温静置后上离心机（2 000 r/min）离心20 min，取上清液分装，于—80 ℃低温保存。2 号管低温冻存后，于RNA 提取前行充分解冻，取0.25 ml与Trizol 液以1∶3 比例混合震荡，室温静置5 min后，2 000 r/min，4 ℃恒温离心10 min，静置后取上清。加入氯仿0.2 ml 后重复离心10 min，静置后取水相（约500l）。加入异丙醇500l 后震荡，室温静置30 min 后重复离心10 min 去上清保留RNA 沉淀，加入75%乙醇重复离心3 min，静置3 min 后，上超微量紫外分光光度计（赛默飞）测定总RNA 纯度良好。以双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清BDNF、NfL 水平，采用实时荧光PCR 法（RT-PCR）测定miR-132。

1.2.2 RMI脑部形态学检测 采用1.5TMR（I明峰），选择T1WI、T2WI、FLAIR、DWI 序列（常规扫描）以及TOF-3D-MRA 扫描。视野（FOV）=240 mm×240 mm；厚度6 mm，层距1 mm，矩阵256×256。患侧时嘱患者取卧位，扫描范围从炉顶至颅底。横轴位、矢状位定位线与大脑下缘连线、大镰相平行；冠状位定位线与海马长轴相垂直。FLAIR 序列垂直于海马长轴斜进行冠状位扫描（厚度0.5 mm），获得斜冠状面海马图像后，经三维体积分析得到海马体积。

1.2.3 量表指标评估（1）认知障碍评估采用蒙特利尔认知评估量表（MoCA）[6]，该量表针对记忆、语言、注意力集中、执行、抽象思维、视空间结构及计算/定向力7 个方面内容进行系统评估。（2）抑郁状态评估采用PHQ-9 健康问卷[7]，该问卷涵盖心情、睡眠、疲乏感、饮食、负性注意与负性信念及行动等方面，共9 个条目。≤9 分提示无或轻度抑郁，10 ～14 分提示中度抑郁，15 ～19 提示中重度抑郁，≥20 分提示重度抑郁[8]。（3）焦虑状态评估采用广泛性焦虑障碍7 项（GAD-7）[9]，该量表同样基于DSM-IV相关标准，针对患者焦虑情绪、担忧、难以放松、坐立不安、烦躁等7 个方面进行评估，≤4 分提示被试无焦虑，5 ～9 分提示轻微焦虑，10 ～13 提示中度焦虑，14～18 提示中重度焦虑，≥19 分则提示重度焦虑可能。（4）失能状态评定采用Barthel 指数进行评估，该量表包含吃饭、穿越、洗澡、大小便、装饰、如厕、修饰、床椅移位、平地行走（45 m）、上下楼梯等共10 个项目。100 分提示被试独立性良好，75 ～95 分提示轻度依赖，50 ～70 分提示中度依赖，25 ～45 分提示重度依赖，0 ～20 分提示完全依赖[10]。

1.3 统计方法 采用SPSS 23.0统计软件进行分析。正态计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验或t’检验；非正态计量资料以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney U 检验；计数资料比较采用检验。预测价值评估采用ROC 曲线分析，求曲线下面积（AUC）；多因素分析采用Logistic 回归分析。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组评估指标比较 两组年龄、受教育程度、高血压、糖尿病、海马体积缩小、MoCA评分、GAD-7 评分、Barthel 指数以及外周血BDNF、miR-132 和NfL水平差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见表1。

表1 两组评估指标比较

2.2 BDNF、miR-132 和NfL 对aMCI 向AD 转化的风险预测价值 外周血BDNF、miR-132 和NfL 水平对aMCI 向AD 转化风险的ROC 曲线下面积分别为0.729、0.652 和0.804，具体灵敏度、特异度、临界值等指标见表2。外周血NfL 水平对aMCI 患者向AD转化的风险预测价值高于miR-132（Z=2.917，P ＜0.05），其他指标间差异无统计学意义（均P ＞0.05）。

表2 BDNF、miR-132 和NfL 对aMCI 向AD 转化的风险预测ROC 曲线分析

2.3 影响aMCI 向AD 转化的多因素分析 将组间差异有统计学意义的指标作为自变量，认知减退程度（aMCI 或AD）作为因变量带入Logistic 回归方程。结果得到，Hosmer-Lemeshow 拟合度（H）检验（=5.146，P=0.742），拟合度良好。模型系数检验Omnibus 检验，决定系数（R2）=0.713，P ＜0.05，回归模型效能良好。年龄、海马体缩小、MoCA 评分、GAD-7 评分及外周血BDNF、miR-132 和NfL水平是aMCI 向AD 转化的影响因素（均P ＜0.05），见表3。

表3 aMCI 向AD 转化风险的多因素Logistic 回归分析

3 讨论

MCI 是一种介于正常衰老与轻度痴呆的中间过度状态，由于MCI与AD 患者脑灰质与皮质的进行性萎首先累及脑内测颞叶的海马区[11]，这部分脑区与记忆功能相关；因此，以记忆功能损伤为主要表现的aMCI 患者在MCI 中占较大比重。本研究即针对aMCI 向AD 转化的风险评估因子进行分析。以往的检测手段如计算机断层扫描（PET）、脑脊液（CSF）检测等，因检测成本高且具有侵入性，阻碍了其临床推广。随着对AD 相关外周血分子生物标志物检测的研究，不仅提高了了疾病的早期诊断能力，还对药物的实验研究与临床推广起到了推动作用[12]。

本研究选择的外周血生物标志物包括BDNF、miR-132 和NfL 3 种。BDNF 广泛表达于大脑皮质及海马等多脑区，具有神经保护作用，对中枢神经系统神经元的发育、存活、维持和修复具有重要意义[13]。本研究结果显示，AD 患者血清BDNF 水平显著低于aMCI，进一步行ROC 曲线分析显示，其对aMCI向AD 转化风险具有一定的量化预测评估价值，AUC为0.729，计算求得诊断临界值为12g/L，该临界值具有较高的敏感度（87.78%），但特异度相对偏低（50.60%）。多因素分析显示，BDNF 对aMCI 向AD 转化风险的影响为负性（ =—0.322），OR 值为0.724。当aMCI 患者血清BDNF 水平低于诊断临界值时，应重点关注。

miR-132 作为微小RVA 家族成员之一，与炎性反应，血管生长以及中枢神经系统突触生长、分化、形态维持及凋亡等均具有密切关系[14]。本研究ROC曲线分析结果显示，miR-132 预评估诊断价值偏低（AUC=0.652）；多因素分析显示，miR-132 对aMCI向AD 转化风险的值达到—4.574，OR 值达到了0.010。因此，其对转化风险的评估需同时考虑其他因素的影响，并在多因素条件下进行分析。

神经轴索损伤和丧失是诸多慢性神经系统疾病的主要病理特征，NfL作为神经丝的一个亚单位，对神经元细胞损伤和死亡具高度特异性，与神经细胞塑形以及髓鞘轴突再生密切相关[15]，是神经细胞骨架的重要成分。本研究结果显示，血清NfL 水平对aMCI 向AD 转化风险具有较好的预评估价值（AUC=0.804），诊断临界值为77.5 ng/L，但其灵敏度仅为50%，但特异度达到96.39%，可针对其较高的特异度对预评估样本中的假阳性样本进行鉴别。多因素分析结果显示，其对转化风险的值为0.185，OR值为1.203。

总之，外周血BDNF、miR-132 和NfL 作为良好的生物学指标，对提示疾病进展，阻止或延缓aMCI患者潜在的病理进程，改善症状，保护残存的脑功能提供早期风险评估依据。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 张金娜：设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、文章撰写；颜蓉：获取研究经费、行政、技术或材料支持、指导、对文章的知识性内容作批评性审阅。