不同酶组合致兔眼玻璃体液化的实验研究

陈萍萍，骆阳，徐博怀，杨路

玻璃体是眼睛屈光介质的一个组成部分，水占玻璃体的98%，大分子物质占玻璃体的0.15%，包括透明质酸、胶原纤维和可溶性的蛋白质[1]。主要结构成分是细纤维网状支架中的II型胶原纤维和交织于支架间的透明质酸粘多糖，其中Ⅱ型胶原纤维是玻璃体中的主要胶原成分，占胶原纤维总量的70%～80%[2]。胶原纤维的支架结构随着年龄增长而收缩和塌陷，进一步导致玻璃体液化和玻璃体后脱离（PVD）。玻璃体的液化与许多眼病有关，如黄斑裂孔、视网膜脱离及玻璃体积血等[1]。因此，构建玻璃体液化模型，进一步研究玻璃体液化机理，寻求更好的预防和治疗方法具有重要意义。目前已发现有多种酶可诱发玻璃体液化，如软骨素酶（CA）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、透明质酸酶（HA）、纤溶酶（PL）、胶原酶、中性蛋白酶及纳豆激酶等[3]。本研究应用20 IU HA 联合1 IU PL 及0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 两种组合酶进行兔眼玻璃体腔内注射，对兔眼进行临床检查及HE 染色，旨在观察及比较两种组合酶诱导玻璃体液化及PVD的快速性、有效性和安全性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物准备 健康成年新西兰白兔24 只（由宁波大学医学部实验动物中心提供），雌雄不拘，月龄为4～5 个月，体质量为2.5 ～3.0 kg。将24 只白兔采用完全随机分组法分成3 组，A 组11 只，B 组11 只，C组2 只作为空白组，A 及B 组均以右眼为实验眼，左眼为对照眼。实验前复方托吡卡胺眼药水散瞳，做常规眼科检查，包括肉眼、裂隙灯显微镜（＋90 D 前置镜）、间接检眼镜及眼部B超检查等，以排除兔眼疾患。本研究经宁波大学实验动物伦理委员会审批通过。1.2 实验试剂 HA（北京索莱宝产品）、PL（美国Sigma 产品）、CA（美国Sigma 产品）、MMP-3（美国Sigma 产品），在注射前均用平衡盐溶液（BSS 液）稀释，浓度分别为20 IU/0.05 ml、1 IU/0.05 ml、0.2 U/0.05 ml 和10 ng/0.05 ml。

1.3 方法 玻璃体腔注射：注射前1 d 两组兔眼均用加替沙星眼膏涂眼2 次，全身麻醉后两组实验眼于视乳头前玻璃体后1/3 部位分别注射20 IU HA联合1IU PL 及0.2 U CA 联合10 ng MMP-3，两组对照眼相同部位注射BSS 0.1 ml，C 组不做任何处理。术后加替沙星眼药膏涂眼，继续2 次/d，用3 d。所有操作均为同一组人员完成。

1.4 观察指标 在注射后1 h 进行第一次观察，之后每天观察1 次直至其被处死。在每次观察之前，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，丙美卡因眼药水眼表麻醉，而后将兔子固定于兔子固定器内，用开睑器撑开上下眼睑进行眼部检查。观察项目：肉眼、裂隙灯显微镜、＋90 D 前置镜及间接检眼镜检查，主要检查是否有炎症反应，晶状体、玻璃体和视网膜的变化。如果在第一次检查中发现手术引起的眼部损伤，则该兔眼不纳入实验。检查后滴用乳酸左氧氟沙星滴眼液。每天进行眼部B 超检查，检查后用加替沙星眼药膏涂眼。注射后3、7、14 d 采用简单随机抽样法分别从A组及B组中各随机选择2 只兔子（4 只眼），并于第14 天从空白组中随机抽取兔一只（2 只眼）。眼球摘除后，从3 组中随机抽取的兔子里再任取1 只兔子（2 只眼）进行冰冻切片后HE 染色，用光学显微镜检查。另一只兔子（2 只眼）放在—80 ℃冰箱内存储。1.5 统计方法 采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析，计数资料比较采用Fisher精确概率法，P＜0.05表示差异有统计学意义。当进行两组之间比较时，值采用Bonferroni调整后的水平进行判断，调整水平为0.017，为原水平（0.05）与分组数量（3）的比值，两两比较时P ＜0.017 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察 A 组及B 组的前房炎症反应、玻璃体混浊、玻璃体液化、部分性PVD 及完全性PVD 见表1 ～2，裂隙灯（＋90 D 前置镜）检查兔眼玻璃体可见浓缩玻璃体后皮质，眼部B超检查兔眼玻璃体，可见玻璃体完全后脱离，见图1。

图1 裂隙灯显微镜联合眼部B 超观察兔眼结果

表1 A 组实验眼临床观察结果只眼

表2 B 组实验眼临床观察结果只眼

2.2 HE 染色结果 实验组和对照组兔眼术后视网膜形态和细胞结构在光学显微镜观察下与正常组相比无明显异常，视网膜的神经节细胞、双极细胞、光感受器细胞及视网膜色素上皮细胞均无水肿、破裂和坏死，结构清晰完整，排列整齐，视网膜厚度无明显改变，见图2。

图2 视网膜冰冻切片光学显微镜检查结果（HE 染色，×400）

2.3 注射后不同时间PVD形成的眼数 注射后第3天，3 组PVD 差异无统计学意义（P ＞0.05），在注射后第7 天，3 组PVD 差异有统计学意义（P ＜0.05）。A和B组实验眼PVD差异无统计学意义（P＞0.017），两组药物引起完全性PVD 及部分性PVD 差异有统计学意义（P ＜0.017）；A、B 组实验眼与对照组PVD差异均有统计学意义（均P ＜0.017）。注药后第14天，3 组PVD 差异有统计学意义（P ＜0.05）；A 组实验眼与B 组实验眼PVD 差异无统计学意义（P ＞0.017），两组药物引起完全性PVD及部分性PVD差异无统计学意义（P ＞0.017）；A、B 组实验眼与对照组PVD 差异均有统计学意义（均P ＜0.017）。A 组药物注射后3、7、14 d 形成PVD 差异有统计学意义（P ＜0.05）；B 组药物注射后3、7、14 d 形成PVD 差异有统计学意义（P ＜0.05），且在3 d 与7 d 以及3 d与14 d 形成PVD 差异均有统计学意义（均P ＜0.017）。B 组3 d 与7 d 药物诱导完全性PVD 及部分性PVD 差异有统计学意义（P ＜0.017），见表3。

表3 注射后不同时间实验组和对照组兔眼PVD 的形成情况只眼

3 讨论

药物的眼内注射部位对PVD的形成非常重要。由于玻璃体胶原纤维和透明质酸在玻璃体后皮质具有高密度，并且玻璃体后皮质紧密地黏附于黄斑、视乳头及血管周围[4]。因此，本研究将药物注射到兔眼玻璃体中后1/3 处，很好的诱导出兔眼PVD。

本实验研究发现两组联合酶均能有效诱导玻璃体液化及PVD，HA 可以快速有效地降解存在于玻璃体胶原纤维之间的透明质酸聚合物，导致玻璃体凝缩并促使玻璃体支架塌陷，这有利于PL快速扩散到玻璃体视网膜交界处[5-6]。PL 能够降解在玻璃体视网膜交界面的层粘连蛋白、纤连蛋白及其他分子胶。PL 能激活基质金属蛋白酶, 促使视网膜内界膜Ⅳ型胶原降解，从而诱导完全性PVD[7]。虽然PL不能直接降解玻璃体视网膜交界面的IV型胶原，但它可以间接将IV 型胶原纤维暴露，使其被其他酶消化[8-9]，还通过激活胶原酶，释放弹性蛋白酶，产生纤维连接蛋白降解产物，起到消化IV 型胶原纤维的作用[10-11]。MMP-3 能在玻璃体视网膜交界面特异性水解细胞外基质，如纤连蛋白及层粘连蛋白等[12]。CA 能特异性水解硫酸软骨素蛋白多糖，从而破坏玻璃体凝胶稳态，同时还可降低玻璃体视网膜界面的分子粘连[13]。

虽然两组联合酶在形成PVD 方面总体结果大致相同，但在注射后7 d形成完全性PVD和部分PVD时，0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 的效果明显好于20 IU HA 联合1 IU PL。而且，笔者在进一步比较每组联合酶的术后3、7、14 d 形成PVD 时，发现A 组在注射后7d 时，仍未全部形成PVD；在注射后14d 时，仍有2 只兔眼未形成完全性PVD。而B 组在注射后7d已全部形成PVD；在注射后14 d 全部形成完全性PVD。这说明0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 组诱导形成玻璃体液化及PVD 的快速性优于20 IU HA 联合1 IU PL 组。0.2U CA 联合10 ng MMP-3 组也有不足之处，如药物引起眼前房炎症反应较重，不过在注射5 d 后均恢复正常且未见明显视网膜异常。

综上所述，本实验证实了0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 及20 IU HA 联合1 IU PL 应用玻璃体内注射均可以诱导玻璃体液化和完全性PVD的发生，并且对眼组织无明显毒性作用，两组联合酶诱导形成玻璃体液化及PVD总体结果基本一致，这说明这两组联合酶均是药物诱导PVD 的一种较为理想的试剂。但是0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 诱导玻璃体液化及PVD更具快速性且在第7 天诱导效果更佳。因此，0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 所致兔眼玻璃体液化效果更为快速、安全及有效。若使用其中一种联合酶建立玻璃体液化模型进行研究，需综合考虑其研究目的，快速形成PVD且不需要前期采取房水研究，建议选用0.2 U CA 联合10 ng MMP-3；需要采取房水做进一步研究且无时间限制，考虑到0.2 U CA 联合10 ng MMP-3 注射引起前期的前房炎症反应较重，可能会影响房水测定，建议选用20 IU HA联合1 IU PL。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 陈萍萍：实验操作、论文撰写；骆阳、徐博怀：数据整理、统计学分析；杨路：研究指导、论文修改、经费支持