骨髓增生异常综合征患者治疗效果的影响因素及与MTHFR基因多态性的关系

梅书豪,邢玉,刘璐,王鹏远

(许昌市中心医院 a.血液内科;b.肿瘤科,河南 许昌 461000)

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)以细胞分化、形态异常、血细胞减少为主要特征,是一种异质性造血疾病,具有进展转化为急性白血病的高风险[1]。依国际预后评分系统(the international prognostic scoring system,IPSS)危险度,临床MDS治疗过程中,针对低危患者往往以支持疗法为主,并给予免疫调节辅助;针对高危患者,则给予传统疗法联合化疗或干细胞移植,达到多克隆造血重建、有效延长患者生存期的目的[2]。然而,虽然干细胞移植是目前为止MDS治愈唯一方法,但受年龄、配型等诸多限制,多数患者均无接受此项治疗的机会。近年来,MDS疾病发生发展过程中DNA甲基化异常发挥的关键性作用愈发受到关注,与此同时去甲基化治疗也成为临床研究热点之一。地西他滨为5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷,具双重作用机制,高浓度时表现出细胞毒性作用,而低浓度时则可发挥肿瘤胞嘧啶替代作用,使DNA甲基转移酶失活,加强抑癌基因表达,达到抗肿瘤的目的[3]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢限速酶,催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原转化为5-甲基四氢叶酸,前者参与DNA合成修复,后者则是机体主要甲基供体,参与DNA甲基化过程。MTHFR对于DNA合成、活化、修复具有重要调控作用[4]。本研究分析MDS患者疗效的影响因素,探讨MTHFR基因多态性与疾病疗效的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年2月至2022年6月许昌市中心医院收治的82例中高危MDS患者,均接受地西他滨治疗。其中男49例,女33例;年龄34～78岁,平均(58.14±9.77)岁;其中难治性贫血(refractory anemia,RA)3例,难治性血细胞减少伴多系发育异常(refractory cytopenia with multilineage dysplasia,RCMD)37例,难治性贫血伴原始细胞增多(refractory anemia with excess blasts,RAEB)1型与2型分别18、24例;IPSS危险分级中危1者39例,中危2者19例,高危者24例。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准:(1)符合《血液病诊断及疗效标准》[5]MDS诊断标准;(2)符合IPSS危险分层中高危诊断;(3)年龄≥18岁;(4)患者和家属签署知情同意书。排除标准:(1)合并其他部位恶性肿瘤;(2)合并严重器质性疾病;(3)入组前接受过放化疗治疗;(4)3个月内使用过细胞毒性类药物或激素类药物;(5)合并传染性疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1治疗方法

所有患者均接受止吐、护胃、保肝等常规支持治疗,并接受地西他滨(正大天晴药业集团股份有限公司,国药准字H20120067)治疗,给药剂量为每日20 mg·m-2,微量泵泵注,1 h泵注完毕,第1～5天不间断给药,每28日为1个周期,持续治疗4个周期。

1.3.2一般资料收集

收集患者入院时基础资料,包括性别、年龄、疾病分型、IPSS危险分级、7号染色体异常、粒细胞缺乏、贫血情况以及血红蛋白、血细胞计数水平等。

1.3.3基因多态性检测方法

患者入院后采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测MTHFR基因位点多态性。抽取患者静脉血4 mL,提取样本基因组(血液基因组提取试剂盒:贝克曼,AMPurea XPDNA),以双蒸水溶解,检测纯度,-80 ℃保存,引物合成由苏州泓迅生物科技有限公司。基因位点:rs1801131上游5’-CTGTGCTGTGCTGTTGGAAG -3’,下游5’-ACGATGGGGCAAGTGATG-3’;rs1801133上游5’-TCCTCTTCCCCTGCCTTTG -3’,下游5’-CCACTCCAGCATCACTCACTTT -3’。应用Sequenom MassAR-RAY 技术分型。目的基因扩增:取基因组DNA,加入96孔板,取DNA(5 ng )、引物(2.5 pmol)、Taq聚合酶(0.1 U) 、10 mmol·L-1dNTP(0.5 μL)。PCR扩增:96 ℃ 15 min,96 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,76 ℃ 45 s,循环40次,76 ℃ 5 min。SAP反应:去除剩余dNTP,36 ℃ 40 min,86 ℃ 5 min。单碱基延伸:延伸引物(5.4 pmol)、混合物l dNTP、ddNTP(50 μmol )、DNA聚合酶(0.5 U) ,96 ℃ 2 min,96 ℃ 5 s,56 ℃ 5 s,76 ℃ 5 s,循环35次,74 ℃ 3 min。树脂脱盐,转移至芯片检测。

1.4 疗效评估方法

参照《骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识(2014年版)》[6]评估疗效。(1)完全缓解:骨髓系细胞成熟正常,原始细胞≤5%,允许血细胞异常发育;外周血血红蛋白、中性粒细胞绝对值、血小板计数水平分别在110 g·L-1、1.0×109L-1、100×109L-1及以上,原始细胞消失。(2)部分缓解:与治疗前相比,骨髓原始细胞减少幅度达到50%及以上,但仍超过5%;外周血同完全缓解。(3)骨髓完全缓解:与治疗前相比,骨髓原始细胞减少幅度超过50%且≤5%;外周血若达血液学改善,需予注明。(4)血液学改善(疗效维持8周及以上):与治疗前相比红细胞的输注减少,血红蛋白升高达15 g·L-1及以上;对于治疗前血小板水平在20×109L-1及以上者,净增值需达30×109L-1及以上,治疗前水平在20×109L-1以下者,增高达20×109L-1以上且与治疗前相比增高值至少增达100%。(5)疾病稳定:未达部分缓解标准,疾病无进展维持8周以上。(6)治疗失败:治疗过程中疾病出现进展甚至死亡。治疗有效为完全缓解、骨髓完全缓解、部分缓解、血液学改善之和。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件处理数据。计数资料以例数和百分数[n(%)]表示,组间通过χ2检验比较,通过logistic分析MDS患者疗效的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有效组与无效组一般资料

有效组与无效组性别、年龄、疾病分型、IPSS危险分级、血红蛋白水平及是否粒细胞缺乏、重度贫血比较差异无统计学意义(P>0.05);7号染色体异常、血小板计数≥100×109L-1患者治疗有效率高于7号染色体无异常、血小板计数<100×109L-1患者(P<0.05)。见表1。

2.2 有效组与无效组患者MTHFR基因型以及基因频率分布

有效组与无效组MTHFR基因rs1801133位点基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05);有效组MTHFR基因rs1801131位点CC基因型以及C频率低于无效组(P<0.05)。见表2。

表2 有效组与无效组MTHFR基因型以及基因频率分布

2.3 影响疗效的危险因素分析

将上述差异有统计学意义项作为自变量并进行赋值,7号染色体异常(否=0,是=1)、血小板计数水平(<100×109L-1=0,≥100×109L-1=1)、MTHFR-rs1801131(A/C)(AA或AC型=0,CC型=1)。logistic回归分析结果显示7号染色体异常、血小板计数≥100×109L-1的MDS患者治疗有效率更高,MTHFR基因rs1801131位点CC基因型是疗效不佳的危险基因型,OR=1.508(95% CI:1.111～2.048)。见表3。

表3 影响MDS患者疗效的相关因素分析

3 讨论

研究显示,临床MDS发病率达3/10万～5/10万,老年人群中达20/10万～50/10万,是常见的恶性血液病之一,病因尚不十分明确,可能与烷化剂、有机毒物、放射线暴露等有关[7]。

作为去甲基化药物,地西他滨可抑制DNA甲基转移酶,重新激活抑癌基因,诱导肿瘤细胞凋亡,促使其向正常细胞分化,延缓急性白血病转化[8]。肿瘤细胞内,地西他滨被磷酸化后与DNA甲基转移酶Ⅰ结合,抑制胞嘧啶甲基化,激活沉默的抑癌基因,促进造血细胞分化。在中国上市后,关于地西他滨应用于MDS中疗效的报道相继出现。Ma等[9]回顾性分析87例MDS地西他滨治疗患者,中位治疗4个疗程后,治疗有效率达58.6%;Lee等[10]研究发现中高危MDS患者经地西他滨治疗后的总有效率达62.5%。本研究将地西他滨应用于中高危MDS患者的临床治疗中,有效率达到71.95%,略高于上述研究结果[10],这可能与纳入患者基线资料以及用药疗程等存在差异有关。IPSS危险分级是目前应用广泛的MDS预后评估方法,且中低危患者生存期长于高危患者。Liu等[11]研究中治疗有效与无效的MDS患者IPSS危险分级比较无明显差异,并认为中低危患者并不比高危患者更易得到疾病缓解,而是与反应维持时间有关。本研究结果显示,IPSS分级对患者疗效无显著影响。7号染色体异常是MDS预后不良危险因素之一,然而研究证实,7号染色体异常者往往对于地西他滨治疗获益更大[12]。本研究也显示7号染色体异常者可获得更高的治疗有效率,与上述研究结果[12]一致,这可能是由于7号染色体长臂7q22、7q34-q36区域含2个肿瘤抑制基因,并与去甲基化药物耐药性有关。既往研究显示,血小板反应是MDS患者临床地西他滨反应获得的重要预测指标之一[13]。本研究也显示血小板计数大于100×109L-1的患者可获得更高的治疗有效率,与上述研究结果[13]一致。

MTHFR基因位于1p36.3染色体,具有外显子11个,可将5,10-亚甲基四氢叶酸还原转化为5-甲基四氢叶酸,在DNA修复与甲基化中发挥重要作用。5-亚甲基四氨叶酸可转化为S-腺普甲硫氨酸,S-腺普甲硫氨酸为DNA甲基化甲基来源。MTHFR基因rs1801131、rs1801133位点为该基因常见突变位点。既往相关研究显示MTHFR基因rs1801131位点突变是直肠癌RO切除术后辅助化疗预后不良的独立危险因素[14]。本研究中rs1801131位点CC基因型是MDS患者疗效不佳的独立危险因素之一,CC基因型患者疗效不佳风险是AA及AC基因型患者的1.508倍,rs1801131位点A向C突变可使丙氨酸替代谷氨酸,CC基因型酶活性仅为AA型的40%,从而引起S-腺普甲硫氨酸与叶酸缺乏,导致DNA甲基化受阻,影响地西他滨药物利用率。白小红等[15]研究显示rs1801133位点的基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病临床疗效无关,但与患者化疗相关不良反应相关。本研究结果显示有效组与无效组rs1801133位点基因多态性比较无明显差异。本研究不足之处在于未排除种族等混杂因素,研究结果不能扩展到本域外,同时未对患者不良反应、生存期等资料行进一步分析,后续将扩大样本量作进一步研究。

4 结论

7号染色体异常、血小板计数≥100×109L-1的MDS患者接受地西他滨治疗的有效率较高,MTHFR基因rs1801131位点CC基因型是疗效不佳的危险基因型。