异钩藤碱抗血小板聚集和释放作用的研究

李铭铭,罗云梅,李映莹,谢笑龙,2a,2b

(1.遵义医科大学第三附属医院/遵义市第一人民医院 药剂科,贵州 遵义 563000;2.遵义医科大学 a.基础药理教育部重点实验室/特色民族药国际合作联合实验室;b.贵州省基础药理重点实验室;c.药学院,贵州 遵义 563000)

血小板是骨髓巨核细胞质脱落下来的小块,是血液循环中的无细胞核颗粒,主要参与机体的止血活动和血栓形成[1-2]。在正常生理条件下,血小板以无活性形式在血液中循环,内皮细胞的缺损以及凝血级联反应会诱导血小板的激活,促进血小板颗粒内容物的释放,如五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血小板因子4(platelet factor 4,PF4)和血栓素2(thromboxane 2,TXA2)等,并互相黏附成聚集物,进一步促进血小板的活化[3]。血小板聚集及血栓形成参与了多种心脑血管疾病的发生发展,如动脉粥样硬化、脑梗死和外周血管疾病,在这些疾病中,血小板活化引起的动脉栓塞可致残或致死[4-5]。因此,发现有效的抗血小板药并探究其作用机制具有重要的临床意义。

异钩藤碱(isorhynchophylline,Isorhy)是从钩藤中提得的一种生物碱,有降压、扩张血管、缓解肺纤维化及减慢心率等作用[6-8]。前期研究发现Isorhy具有抗血小板聚集及抗血栓形成作用[9-10]。而Isorhy对血小板5-HT及PF4释放、对MDA生成以及对血小板解聚作用的影响尚不清楚。本研究通过体外实验进一步探讨Isorhy抗血小板聚集可能的机制,为寻找新的抗血小板药物提供基础药理实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

雄性家兔,体重2.0～3.0 kg,由遵义医科大学实验动物中心提供。动物实验经遵义医科大学动物实验伦理委员会审查批准(批准号[2018]2-128)。 Isorhy购于广西东兰制药厂,纯度>97%;邻苯二甲醛,半胱氨酸及Triton X-100购自中国医药集团化学有限公司;阿司匹林(acetylsalicylic acid,ASA)、凝血酶、胶原、花生四烯酸及5-HT购自Sigma公司;MDA检测试剂盒购自南京建成责任有限公司。荧光分光光度计,岛津公司产品,型号RF-5000;血小板聚集仪,普利生公司产品,型号LBY-NJ4;可见分光光度计,上海申化仪表自控公司产品,型号721。

1.2 方法

1.2.1血小板血浆制备

健康家兔,使用普鲁卡因(5 mg·kg-1)局部麻醉,颈动脉采血,参照刘炎东等[11]的方法加入50 g·L-1枸橼酸钠抗凝(血液∶抗凝剂=9∶1),1 000 r·min-1离心5 min,离心半径为15 cm,分离富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP),剩余血浆再3 000 r·min-1离心10 min,离心半径为15 cm,分离贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP)。用PPP调整血小板计数为400×109L-1,37 ℃静置1 h后将血小板计数为400×109L-1的血浆分为对照组、Isorhy低(0.33 mmol·L-1)、中(0.65 mmol·L-1)、高(1.30 mmol·L-1)剂量组(L、M、H)和阳性药ASA(1.69 mmol·L-1)组。

1.2.2血小板聚集仪检测血小板聚集率

取血小板计数为400×109L-1的血浆 220 μL,分别加入5 μL异钩藤碱和ASA母液,使低、中、高终浓度分别为0.33、0.65、1.30 mmol·L-1,ASA终浓度为1.69 mmol·L-1。对照组加入5 μL生理盐水,37 ℃恒温孵育5 min,测定时分别加入诱导剂胶原(终浓度60 mg·L-1)和凝血酶(终浓度0.35 mmol·L-1)测定血小板聚集率,与周宙等[12]方法一致。

1.2.3荧光分光光度计检测5-HT的释放

分别取0.4 mL PPP和PRP及血小板已聚集的PPP与0.1 mL 5 g·L-1Triton X-100混合,随后加入3 mL酸性正丁醇,将混合液振摇,离心,1 200g,5 min。取有机相2.5 mL,加入正庚烷5 mL,0.1%半胱氨酸1 mL,振荡混匀,1 200g离心5 min,弃去有机相,3 mL 0.04 g·L-1邻苯二甲醛加到由10 mol·L-1HCl组成的0.5 mL水相,然后水浴加热15 min。液体冷却后以荧光分光光度计测定荧光强度值(激发波长365 nm,发射波长480 nm)。5-HT含量=PPP荧光值/标准管荧光值×样品量×1/0.9。

1.2.4记录胶原作用后PF4的生成

将50 μL不同浓度的Isorhy加入0.5 mL PRP中,5 min后加入胶原(终浓度为40 mg·L-1)终止反应,混合液冷却后170g离心10 min,取0.1 mL上清PPP,加入肝素(0.6 U·mL-1)0.1 mL,20 s后加0.1 mL凝血酶,使终浓度为3 kU·L-1,记录肝素凝血酶凝固时间(heparin thrombin coagulation time,HTCT)。

1.2.5硫代巴比妥法检测MDA的生成

在试管内加入200 μL PRP,然后分别加入Isorhy和ASA使终浓度分别为0.33、0.65、1.30 mmol·L-1(Isorhy)、1.69 mmol·L-1(ASA)。对照组加入生理盐水。所有样本置37 ℃水浴,2 min。加入凝血酶使终浓度达到10 kU·L-1。样品加入后37 ℃反应5 min,以冰冷的三氯乙酸和盐酸终止反应。冰盐浴30 min后1 200g离心15 min。取0.15 mL上清液,以可见分光光度计测定532 nm处吸光度值。

1.2.6血小板聚集仪检测血小板解聚率

取290 μL PRP,加入5 μL凝血酶,使终浓度为3 U·mL-1。生理盐水组为对照,以Born氏比浊法测定血小板聚集率。在血小板聚集达峰值时, 加入10 μL Isorhy,使终浓度依次分别为0.33、0.65和1.30 mmol·L-1,记录30 min的血小板聚集率。血小板解聚率=(血小板解聚峰值—给药组聚集率)/血小板解聚峰值。

1.2.7统计学分析

2 结果

2.1 Isorhy对血小板聚集的影响

本实验采用了胶原和凝血酶2种不同的诱导剂建立血小板聚集模型,结果显示,Isorhy低剂量0.33 mmol·L-1、中剂量0.65 mmol·L-1和高剂量1.30 mmol·L-1在2种模型中血小板聚集率均小于对照组(P<0.05),并呈现浓度剂量依赖性,与ASA具有相似的效应。见图1。

A为Isorhy对胶原诱导的血小板聚集的影响;B为Isorhy对凝血酶诱导的血小板聚集的影响;与对照组比较,*P<0.05。

2.2 Isorhy对胶原诱导的血小板5-HT释放的影响

以胶原(50 mg·L-1)诱发血小板聚集,测定上清液5-HT含量。结果显示Isorhy中剂量0.65 mmol·L-1和高剂量1.30 mmol·L-1浓度依赖性地抑制血小板5-HT释放(P<0.05),与ASA具有相似的效应。见图2。

与对照组比较,*P<0.05。

2.3 Isorhy对HTCT的影响

以胶原(50 mg·L-1)诱导血小板聚集后,测量HTCT。Isorhy低剂量0.33 mmol·L-1、中剂量0.65 mmol·L-1和高剂量1.30 mmol·L-1浓度依赖性地延长HTCT(P<0.05),与ASA具有相似的效应。见图3。

与对照组比较,*P<0.05。

2.4 Isorhy对凝血酶诱导血小板MDA生成的影响

Isorhy低剂量0.33 mmol·L-1、中剂量0.65 mmol·L-1和高剂量1.30 mmol·L-1浓度依赖性地抑制血小板MDA生成(P<0.05),与ASA具有相似的效应。见图4。

与对照组比较,*P<0.05。

2.5 Isorhy对血小板解聚的影响

Isorhy 中剂量0.65 mmol·L-1和高剂量1.30 mmol·L-1浓度依赖性地升高血小板解聚率(P<0.05),与ASA具有相似的效应。见图5。

与对照组比较,*P<0.05。

3 讨论

血小板聚集是指血小板与血小板之间相互黏着,是血小板的生理特性之一,多种因素可刺激静息血小板活化并聚集,促进血栓的形成,是血液循环系统疾病发生发展的重要因素,因此,筛选抗血小板聚集的药物对血液循环系统疾病的治疗具有重要意义。本实验采用60 mg·L-1胶原和0.35 mmol·L-1凝血酶在体外建立家兔血小板聚集模型,并观察Isorhy对血小板聚集的影响,结果显示,Isorhy在0.33～1.30 mmol·L-1浓度范围内能够剂量依赖性地抑制凝血酶和胶原诱导的血小板聚集,说明Isorhy具有较好的抗血小板的作用,是一种对血液循环系统疾病具有治疗潜力的药物。

5-HT是血小板受到刺激后从致密体释放的主要物质之一,能够与血小板上的5-HT2A受体结合,改变血小板的表面构型,使血小板与其他刺激剂如内皮素、血栓素2和血管紧张素Ⅱ等的受体暴露,增强了血小板反应性,促进血小板的活化和聚集。5-HT还参与了血管收缩舒张以及细胞增殖迁移等过程,在动脉粥样硬化、糖尿病血管病变和肺动脉高压等疾病中扮演重要角色,抑制5-HT的释放对缓解以上疾病的病理状态有积极作用[13-15]。本实验观察了Isorhy对胶原诱导的血小板聚集模型5-HT的释放,发现0.65和1.30 mmol·L-1Isorhy能够有效降低5-HT的释放,其变化趋势与Isorhy抑制血小板聚集变化趋势一致,这说明Isorhy能够通过减少5-HT的释放抑制血小板的聚集活化。有文献报道,凝血酶能够激活血小板,促进花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的释放,AA作为MDA合成的前体,其含量的增加可导致MDA合成增加[16],因此,检测MDA的含量可间接反映血小板的活化程度,MDA也是体现机体氧化应激水平的指标之一,MDA含量的减少提示机体氧化应激水平下调。本研究在体外检测了Isorhy对凝血酶诱导的家兔血小板聚集模型MDA的释放,结果显示Isorhy低、中、高浓度均能降低MDA的含量,并呈现浓度依赖性,说明Isorhy能够抑制血小板的活化,具有降低机体氧化应激水平的潜力。PF4是血小板活化后从α颗粒释放的一种蛋白质,具有中和肝素缩短凝血时间的作用,测定HTCT能够间接反映血浆中PF4的含量,同时反映血小板的功能状态,HTCT与PF4含量呈负相关[17-18]。本研究在检测Isorhy对HTCT的影响时观察到,Isorhy能够浓度依赖性地增加HTCT,提示,Isorhy能够剂量依赖性地减少血浆中PF4的含量,进一步说明Isorhy能够抑制血小板的激活。并且中,高浓度组效果优于临床现有的抗血小板药ASA。

血小板的聚集与解聚是2个结果相反的生理过程,解聚是指血小板从聚集状态到游离状态的过程,促进血小板的解聚能够缓解血栓的形成,对血管栓塞性疾病具有重要意义。本实验采用凝血酶促进血小板的聚集,在聚集达高峰值时加入Isorhy,观察Isorhy对血小板解聚的影响,结果证明Isorhy能够增大血小板的解聚率,说明Isorhy能够促进血小板的解聚,阻止血小板的聚集活化。

4 结论

Isorhy在0.33～1.3 mmol·L-1浓度范围内能够通过降低5-HT、MDA和PF4的释放发挥抗血小板聚集活化的作用,可见将Isorhy开发为新的抗血小板药具有较好的前景。