苦木组织培养与快速繁殖技术研究

洪聪慧,阿米乃#,刘 同,汪长江,冷 英,魏正才,杜克兵*

(1.华中农业大学 园艺林学学院,武汉 430070;2.襄阳市林业科学研究所,湖北 襄阳 441052;3.湖北省林业局林木种苗管理总站,武汉 430079;4.襄阳市自然资源和规划局,湖北 襄阳 441003)

苦木(Picrasmaquassioides)是苦木科(Imaroubaceae)苦木属(Picrasma)的落叶乔木,高可达10m,其树皮、根皮、枝、叶和果实都是极为苦涩的,故称苦木。其在世界范围内具有广泛的分布,在我国主要分布在中部地区、南部地区和东部地区。苦木常生长于海拔1600～2400m的山地杂木林中,喜光、耐旱、耐阴,在贫瘠土地上也可以生长。苦木属于中国的传统药材,以干燥枝和叶入药[1],临床药用价值高[2]。苦木含有以生物碱类为主的化学成分,临床主治感冒、咽喉肿痛等症[3]。现代药理研究表明,苦木具有抗癌、降压、抗蛇毒、抑制转氨酶等作用[4]。苦木提取物(包括苦木水煎液和脂溶性总生物碱)外用具有较好的抗菌和抗炎作用,但其最佳用药剂量、抗炎机制等方面还需深入探究[5]。此外,苦木的木材也可用于制作家具、饰品等,其杀菌效果良好[6]。由于苦木经济价值高,市场需求量大,且目前人工造林较少,野生苦木资源人为破坏非常严重,因此急需开展野生苦木资源的有效保护和人工栽培[7]。苦木扦插生根困难,嫁接成本高且易受季节的限制,生产上多采用播种方式繁殖,但苦木种子的发芽率不高,通过实生繁殖较困难,在短期内无法提供大量苗木。采用组织培养方法,不受时间地点的限制,能较快速地获得苗木。目前关于苦木组织培养和快速繁殖的研究仅有1项技术发明专利:陈培党[8]以苦木细嫩孢子叶为外植体,经过外植体消毒、绿色球状体(green globular bodies,GGB)诱导、增殖、分化、生根等过程建立了苦木离体组培快繁技术。

因此,以苦木优良单株的幼嫩带腋芽茎段为实验材料,对其最佳外植体进行消毒处理,并进行不同浓度6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)、萘乙酸(naphthalene acetic acid,NAA)和3-吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,IBA)的激素组合实验,以筛选适宜的初代培养基、增殖培养基和生根培养基。研究的主要目的在于实现苦木规模化生产,培育苦木优良品系,持续稳定提供优质种苗。

1 材料与方法

1.1 实验材料

材料来源于襄阳市林业科学研究所保存的苦木优良单株,母株树龄8年,树高6.5m,胸径5.2cm。

1.2 培养条件

接种时,每瓶培养基接种1个外植体,每种培养基接种10瓶,每个处理设置3次重复,培养基均进行20min高压蒸汽灭菌(温度为121℃、压力为100kPa)。接种后,将材料置于组培室内培养,光照强度为1500～2000lx,光照时间为16h/d。

1.3 外植体消毒

7-9月的晴天采集苦木母株中上部的幼嫩带芽茎段作为外植体。先在倒有洗衣粉的水中浸泡2min,清洗表面的灰尘,然后放到流水下冲洗2h,把冲洗好的茎段浸在70%酒精中消毒30s;再用无菌水对茎段冲洗2次,每次持续30s;又用0.1%氯化汞进行消毒处理,设置5.0、6.5、8.0min 3个水平;消毒完立即用无菌水冲洗4次,每次冲洗30s,确保茎段表面没有试剂残留;接着用滤纸吸干表面水分,切除茎段上已经褐化的部位;最后切成长3cm的带芽茎段,接种到DKW(Driver-Kuniyuki-Walnut)基本培养基(添加2.50%蔗糖和0.80%琼脂,不添加任何激素)。接种20d后,统计外植体的污染率(P)和褐化率(B),通过统计和计算确定最适宜外植体的消毒时间。污染率公式如下所示:

P=(N1/N)×100%,

(1)

其中:P表示污染率,单位为%;N1表示污染外植体数量,单位为个;N表示接种时外植体总数,单位为个。褐化率公式如下所示:

B=(N2/N)×100%,

(2)

其中:B表示褐化率,单位为%;N2表示褐化外植体数量,单位为个。

1.4 初代培养

通过上述实验筛选出最佳的消毒方法,将经过消毒处理的无菌茎段接种到添加激素的腋芽诱导培养基中,以筛选适宜的初代培养基。初代培养基以DKW培养基为基础,添加2.50%蔗糖和0.80%琼脂,激素种类设置为6-BA(1.00、2.00mg/L)、IBA(0.10、0.20mg/L)、NAA(0.05、0.10mg/L),共8种培养基(I1～I8)。接种30d后,统计腋芽萌发率(G),公式如下所示:

G=(N3/N)×100%,

(3)

其中:G表示腋芽萌发率,单位为%;N3表示萌芽外植体数量,单位为个。

1.5 增殖培养

以初代培养中萌发的腋芽为实验材料,芽高为1～2cm时将其接种到增殖培养基中,以筛选适宜的增殖培养基。以DKW培养基为基础,添加2.50%蔗糖和0.60%琼脂,同时添加不同质量浓度梯度的6-BA、IBA和NAA,不同种类激素共设置13种培养基(P1～P13)。接种35d后,观察芽的增殖情况和生长状况,统计增殖系数(M),以高于1cm的芽记为有效芽。增殖系数公式如下所示:

M=(M1/M2)×100%,

(4)

其中:M表示增殖系数;M1表示培养35d时的有效芽数,单位为个;M2表示接种时的总芽数,单位为个。

1.6 生根培养

以高于2cm的试管苗为实验材料,将其接种于生根培养基中,以筛选适宜的生根培养基。以DKW培养基为基础,分别加入不同质量浓度梯度的IBA和NAA,共组成9种不同激素水平的培养基来进行生根实验(R1-R9)。接种30d后,统计生根率(S)、根系数量和根系长度。生根率公式如下所示:

S=(S1/S2)×100%,

(5)

其中:S表示生根率,单位为%;S1表示培养30d时的生根苗数,单位为个;S2表示接种时的总苗数,单位为个。

1.7 试管苗移栽

生根苗培养30d后,打开瓶盖,对组培苗进行为期7d的驯化。选择生长良好的组培苗,将其移栽于营养土与沙体积比为1∶1的方形营养钵中(尺寸为11cm×11cm),覆塑料杯保湿。每个营养钵中培养1株,15d后移去塑料杯,40d后统计移栽成活率(T),并记录生长状况。移栽成活率公式如下所示:

T=(T1/T2)×100%,

(6)

其中:T表示移栽成活率,单位为%;T1表示成活苗数,单位为个;T2表示移栽苗数,单位为个。

2 数据分析

实验数据采用SAS 8.1统计软件进行单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)和Duncan’s多重比较(P=0.05)。

3 结果与分析

3.1 外植体消毒分析

消毒时间对苦木茎段的褐化率和污染率均产生了显著影响,茎段消毒结果如表1所示。由表1可知,消毒5.0min,平均褐化率和污染率分别为11.67%和43.33%;消毒6.5min,平均褐化率和污染率分别为16.67%和21.67%;消毒8.0min,平均褐化率和污染率分别为38.33%和13.33%。综合茎段褐化率和污染率结果,可知0.1%氯化汞处理6.5min比较适合苦木的茎段消毒,此时正常茎段保存率最高。

3.2 初代培养分析

初代培养结果如表2所示。在初代培养基上接种5～7d后,腋芽开始慢慢膨大,腋芽萌发9～15d后,芽生长速度加快。

表2 初代培养结果Tab.2 Results of initial culture

图1为苦木的组织培养图片。由表2可知,I3培养基上的外植体腋芽萌发率最低,幼芽纤细幼嫩,如图1(a)所示;I4培养基上的外植体腋芽萌发率处于中等水平,幼芽长势一般,如图1(b)所示;I6的腋芽萌发率最高,达到76.67%,显著高于其他培养基,其萌发的幼芽生长健壮,叶色嫩绿,如图1(c)所示。因此,选择I6培养基(DKW+2.50%蔗糖+0.80%琼脂+1.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA)作为苦木的初代培养基。

图1 苦木的组织培养Fig.1 Tissue culture of Picrasma quassioides

3.3 增殖培养分析

增殖培养结果如表3所示。由表3可知,增殖培养35d后,不添加激素的对照(P1)增殖不明显,如图1(d)所示,其平均增殖系数仅为1.33,而外源激素的添加能显著提高芽的增殖系数。其中,P11的增殖系数最高,达到5.67,显著高于其他培养基,为P1的4.26倍。因此,选择P11培养基(DKW+2.50%蔗糖+0.60%琼脂+3.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA)作为苦木的增殖培养基,其幼苗生长健壮,如图1(e)所示。除P1外,P13的增殖系数最低,仅为1.67,其幼苗长势不佳,如图1(f)所示。

表3 增殖培养结果Tab.3 Results of proliferation culture

3.4 生根培养分析

生根培养结果如表4所示。由表4可知,生根培养30d后,不添加激素的对照(R1)没有生根现象发生,即生根率为0,如图1(g)所示。培养基R2～R9的生根情况均优于R1,表明外源激素(IBA、NAA)显著提高了苦木的生根率、生根数量与根的长度。9种生根培养基中,R6的根长最长,平均达到5.23cm,如图1(h)所示。R9的生根率最高,为100.00%,生根数量也最多,为16.67条,如图1(i)所示。

表4 生根培养结果Tab.4 Results of rooting culture

3.5 试管苗移栽分析

组培苗移栽40d后,移栽苗数为20个,成活苗数为19个,成活率达95.00%。图2为苦木移栽后的图片。由图2可知,移栽后的幼苗生长健壮,叶片舒展翠绿。

图2 苦木的移栽Fig.2 Transplanting of Picrasma quassioides

4 讨论

建立外植体无菌体系是植物组织培养成功的前提和关键。在自然环境中生长的外植体往往带有较多的外生菌和内生菌,容易在培养过程中受污染甚至导致死亡[9]。采用适宜的灭菌方法进行外植体消毒是建立无菌培养体系的关键[10-11]。以苦木幼嫩带芽茎段为实验材料,发现0.1%氯化汞消毒不同时长导致外植体的消毒效果显著不同,以6.5min的消毒效果最好;消毒时间缩短(5.0min),则污染率有所提高;消毒时间延长(8.0min),则褐化率随之上升。目前,关于苦木初代培养相关研究的报道极少,实验选择了以DKW为基本培养基,添加了6-BA、NAA和IBA 3种激素进行不同质量浓度组合。研究发现不同质量浓度的6-BA、IBA和NAA组合均可诱导苦木腋芽萌发,但诱导能力存在差异。6-BA+IBA组合对苦木腋芽萌发的促进作用相对较弱,4个组合的平均腋芽萌发率约为27.5%;而6-BA+NAA组合对苦木腋芽萌发的促进作用相对较好,以I6(1.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA)的腋芽萌发率最高,达到76.67%,显著高于其他培养基。增殖培养是组织培养快慢的关键,直接影响组织培养的效率。在增殖培养中,常用外源激素种类为6-BA、IBA和NAA,激素浓度过高或过低均无益于植物的生长,只有适宜的浓度配比才能最大程度地促进植物增殖。胡倩等[12]研究了3个楸树优良无性系的组培快繁技术,发现3种楸树材料对6-BA和IBA浓度的需求不完全相同。实验发现6-BA+NAA组合的增殖系数明显高于6-BA+IBA组合,尤以3.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA组合为最高,增殖系数达到5.67,为对照处理的4.26倍,较大幅度提高了苦木的增殖效率。生根培养直接决定组培苗的生产应用效率[13]。实验发现,外源激素(IBA、NAA)显著促进了苦木茎段的生根率、生根数量与根长度。NAA效果明显优于IBA,且随着NAA质量浓度的提高,生根率和生根数也随之提高,以1.00mg/L NAA +1.00mg/L IBA的生根效果最好,生根率可达100%。苦木生根需要的外源激素浓度较高,可能是由于其体内的生长激素含量较低,导致在组织培养中较难生根,因此需要较高浓度的外源激素来诱导其不定根分化[14]。陈培党[8]以MS(Murashige Skoog)培养基+3.70%蔗糖+0.55%琼脂+1.20mg/L NAA+0.30mg/L IBA为苦木生根培养基,培养22d后生根率也较高,达到97.00%以上。

但陈培党[8]所提供的苦木组培快繁方法,是以苦木细嫩孢子叶为外植体,经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根等过程完成,操作步骤多,周期相对长,且进行增殖培养和GGB分化培养过程中需每2周更换1次培养基。而该实验是以苦木幼嫩带芽茎段为外植体,经过消毒、初代培养、增殖培养和生根培养过程实现扩繁,与GGB诱导相比,操作简单,易记录,成活率也更高。

5 结论

实验主要研究了在苦木的消毒处理、初代培养、增殖培养、生根培养过程中激素种类和浓度配比等因素的影响,初步建立了以组织培养为培育方法的快繁体系,主要研究结果为:苦木茎段外植体经0.1%氯化汞处理6.5min消毒效果最佳,最佳初代培养基为DKW+2.50%蔗糖+0.80%琼脂+1.00mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA,最佳增殖培养基为DKW+2.50%蔗糖+0.60%琼脂+3.00mg/L 6-BA+ 0.10mg/L NAA,最佳生根培养基为DKW+2.50%蔗糖+0.80%琼脂+1.00mg/L IBA+1.00mg/L NAA,健壮组培苗移栽后,成活率可达到95.00%。此研究结果对苦木快速繁殖具有一定指导意义。但实验还存在许多不完善之处,如未进行不同月份的外植体消毒筛选等,苦木组培在生产实践中的应用空白等方面也有待下一步深入研究。