复合除油微生物菌剂的油脂去除特性

凌 玲，李秀芬*

（1. 江南大学 环境科学与工程学院，江苏 无锡 214122；2. 江苏省 厌氧生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；3. 江苏省 水处理技术与材料协同创新中心，江苏 苏州 215009）

随着我国国民经济的快速发展及人们对美好生活的追求，餐饮业规模不断扩大，同时，餐厨垃圾的产生量也以每年10%的速度持续增长[1]。 餐厨垃圾含有高浓度的有机质、油脂和盐，且含水率较高，若不及时处理，易腐败酸化，滋生蚊蝇，污染周边环境[2]。 目前，餐厨垃圾的处理以生物方法为主，主要包括厌氧消化和好氧堆肥两种。 与好氧堆肥技术相比，餐厨垃圾厌氧消化的周期较长、启动较慢、卫生环境条件较差，且会产生大量温室气体，因此餐厨垃圾好氧堆肥处理近年来引起了研究人员的广泛关注[3]。 好氧堆肥过程不仅可消除餐厨垃圾带来的环境污染，所得堆肥产物还可用作土壤有机肥，实现餐厨垃圾的无害化、资源化和减量化，同时还能减少处理过程中的碳排放，有利于固体废物处理向碳中和模式演变，有助于生态文明建设，具有较为重要的现实意义。

油脂是餐厨垃圾的主要组成成分之一，在好氧堆肥过程中较难降解/转化，添加微生物菌剂可大大提高其转化效果，有利于提高堆肥产品的腐熟度及品质。 有研究人员在25 ℃条件下，从皮革废水中筛选得到了4 株油脂降解菌，将其固定化后，该菌剂最高除油率可达86.1%[4]。王亚军等将铜绿假单胞菌以体积分数6%接种到含油脂3 g/L 的培养基中，30 ℃条件下培养3 d，发现油脂去除率达到55.37%[5]。 卢永昌等发现，莴苣不动杆菌对体积分数2%花生油的去除率可达95.7%，此后，随着油脂质量浓度的升高，油脂降解率降低[6]。 Awasthi 等将短芽芽孢杆菌、农业短杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌进行复配，其对油脂的去除率为65.47%[7]。肖翰等将黏至沙雷氏菌接种到病死猪堆肥的堆体中，发现接种体积分数1.0%和1.5%的效果优于0.5%，最终油脂体积分数可降低到15%[8]。

作者以所在实验室自行保藏的4 个微生物菌株为油脂降解菌，通过等比例复配获得了所用复合除油微生物菌剂，研究了温度、pH、含盐量、油脂质量浓度及接种体积分数对除油菌生长及除油效果的影响，进一步研究了组成菌株产脂肪酶的能力，以期扩大油脂降解的菌种库资源，提高餐厨垃圾或餐厨废水中油脂的生物转化效率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

复合除油微生物菌剂的组成菌株：均为作者所在实验室保藏菌株，编号分别为005、009、B409 和B501。 其中菌株005 细胞呈杆状，革兰氏阳性，好氧或兼性厌氧，在营养肉汤培养基（LB）上的菌落呈淡黄色，表面光滑湿润凸起，边缘光滑，易挑起；菌株009 细胞呈棒状，革兰氏阳性，产芽孢，兼性厌氧，在LB 培养基上的菌落呈乳白色，表面粗糙扩展干燥，边缘假根状，不易挑取；菌株B409 细胞呈棒状，革兰氏阳性，产芽孢，好氧，菌落呈乳白色，半透明颗粒状，边缘整齐，表面光滑湿润；菌株B501 细胞呈短杆状，革兰氏阳性，产芽孢，好氧，菌落呈淡黄色，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起，易挑起。

1.2 实验方法

将上述4 个菌株分别接种至装有牛肉膏蛋白胨培养基的摇瓶中，pH 7.0、30 ℃和160 r/min 的条件下振荡培养，每隔12 h 测定一次OD600，待OD600不再变化时，即分别获得4 个菌株的种子液，将4个菌株的种子液按体积比1∶1∶1∶1 比例混合，即获得本研究用复合除油菌剂。

1.2.1 温度对除油菌生长及油脂去除的影响 取体积分数5%的上述复合除油菌剂，投加至装有100 mL 模拟含油废水的三角瓶中，在温度为25、35、45、55 ℃的条件下，研究温度对模拟含油废水的OD600、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响。 模拟含油废水的组成为：（NH4）2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5.0 g，酵母提取物1 g，蒸馏水1 000 mL，大豆油10 g。

1.2.2 pH 对除油菌生长及油脂去除的影响 取体积分数5%的上述复合除油菌剂，投加至装有100 mL 模拟含油废水的三角瓶中，用0.1 mol/L 的HCl 和NaOH 调节pH 分别至4、5、6、7、8、9，研究pH 对模拟废水的OD600、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响。

1.2.3 NaCl 质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响 取体积分数5%的上述复合除油菌剂，投加至装有100 mL 模拟含油废水的三角瓶中，调整NaCl 质量浓度分别至10、30、50、70、90 g/L，研究NaCl 质量浓度对模拟废水的OD600、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响。

1.2.4 油脂质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响 取体积分数5%上述复合除油菌剂，投加至装有100 mL 模拟含油废水的三角瓶中，用大豆油调整油脂质量浓度分别至10、20、30、40、50 g/L，研究油脂质量浓度对模拟废水的OD600、 菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响。

1.2.5 接种体积分数对除油菌生长及油脂去除的影响 取体积分数分别为1%、3%、5%、7%、9%的上述复合除油菌剂，接种至装有100 mL 模拟含油废水的三角瓶中，研究菌剂接种体积分数对模拟废水的OD600、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响。

1.2.6 配方菌株的产酶能力研究 在上述最佳条件下，研究配方菌株所产脂肪酶活性随处理时间的变化情况。

1.3 分析测试项目与方法

1.3.1 模拟废水的OD600测定含菌溶液在波长为600 nm 处的吸光度。

1.3.2 菌体质量浓度 取两支无菌离心管，称质量后，加入一定体积的含菌溶液，8 000 r/min 离心后，弃去上清液，再次称质量后，由式（1）计算菌体质量浓度ρ（g/L）：

式中：m1为无菌管质量，mg；V 为含菌溶液体积，mL；m2为离心后无菌管质量，mg； w 为离心沉淀物的含水率，%。

1.3.3 乳化油脂能力 取1 mL 含菌溶液加入大豆油质量分数为2%的发酵培养基中，30 ℃、160 r/min培养72 h 后，在10 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液1 mL，加入磷酸钾缓冲液 （pH 7.0）5.2 mL，与0.2 mL 大豆油混合，振荡2 min 后，静置10 min，测540 nm 处的吸光度，即得菌剂的乳化油脂能力。

1.3.4 除油率 油脂质量浓度采用紫外分光光度法测定[9]。 除油率Q（%）通过式（2）计算：

式中：ρ0为初始油脂质量浓度，g/L； ρR为反应后油脂质量浓度，g/L。

1.3.5 脂肪酶的酶活 采用《脂肪酶制剂》中的检测方法测定[10]。 脂肪酶催化脂肪水解，生成脂肪酸和甘油，由于生成的脂肪酸使酶反应液变酸，用NaOH 标准溶液滴定，滴定至微红色保持30 s 不褪色，记录NaOH 消耗体积[11]。酶活E（μ/mL）由式（3）计算：

式中：Vs为NaOH 初始体积，mL；Vb为NaOH 滴定后体积，mL； ρNaOH为NaOH 质量浓度，g/L； Df为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 温度对除油菌生长及油脂去除的影响

油脂在水中的溶解度很小，这是油脂很难被微生物降解利用的主要原因。 油脂的溶解度与温度基本呈线性关系，温度越高，溶解度越高，越有利于油脂降解[12]。 温度对除油菌生长及油脂去除的影响如图1 所示。

图1 温度对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig. 1 Influence of temperature on cell concentration and oil removal rate

由图1（a）可见，随温度升高，菌体生长情况略有改善后转而下降，当温度为35 ℃时，OD600和菌体质量浓度均最高，分别为2.71 g/L 和4.40 g/L，其中，OD600与25 ℃相比提高了5.6%，提高幅度不大。当温度继续升高时，OD600和菌体质量浓度明显下降，到55 ℃时分别下降了84.9%和77.3%。 该结果与Ke 等的研究结果相符[13]，即随着温度升高，除油菌OD600降低。

由图1（b）可以看出，油脂乳化能力和除油率与菌剂的生长情况变化一致。 随着温度的升高，复合除油菌剂的乳化油脂能力和除油率均先升高后明显降低，35 ℃时的油脂乳化能力及除油效果最佳，分别为0.567 和82.59%，这与Nayak 等的研究结果相似[14]。 温度升高到55℃时，乳化油脂能力和除油率分别降低了46.6%和31.46%，降幅较大，说明尽管温度升高有利于油脂溶解，高温对菌体生长的抑制是油脂降解的限制条件，同时说明复合除油菌剂的耐高温能力有一定局限，若后续将该复合除油菌剂应用到好氧堆肥中，有必要进一步提高耐高温菌的复配比例，以提高高温阶段复合除油菌剂的除油能力。

2.2 pH 对除油菌生长及油脂去除的影响

pH 对除油菌生长及油脂去除的影响情况如图2 所示。

图2 pH 对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig. 2 Influence of pH on cell concentration and oil removal rate

可见，在pH 5~9 时，OD600和菌体质量浓度分别保持在2.5 g/L 和4.0 g/L 左右，该复合菌剂对pH 的适应性范围较广，生长较为稳定。 当pH 降低至4时，OD600下降较为明显，从pH 为5 时的2.504 降低至1.997，菌体质量浓度也呈现相同的变化趋势，降低至2.5 g/L。 微生物表面电荷受pH 影响，低pH 降低了微生物对营养物质的吸收进而影响其生长[15]。此外，低pH 条件不利于脂肪酶发挥水解作用。在堆肥发酵过程中，可采取一定措施避免体系pH 低于5.0 的情况出现，否则有可能导致酸化，影响微生物活性，甚至导致发酵停止。

从图2（b）可以看出，随着pH 升高，乳化油脂能力和除油率升高，分别从pH 为4 时的0.300 和54.%升高到pH 为7 时的0.606 和79.41%，进一步升高pH 至9 时，乳化油脂能力和除油率分别为0.680 和81.26%。碱性条件下，脂肪在水中的溶解度增大，有利于微生物对油脂的吸收利用[16]，脂肪水解产生的脂肪酸可被碱中和，生成脂肪酸盐，使得该过程持续进行，因此pH 为9 时的乳化油脂能力最强。 综上所述，pH 为7~9 时，菌剂的除油率均在80%以上，该结果与Wu 等和Joo 等学者的研究结果基本一致[17-18]，说明中性偏碱的环境有利于油脂的乳化和降解。

2.3 NaCl 质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响

微生物细胞壁可承受的渗透压为1×104~1×106Pa，相当于氯离子质量浓度2 g/L。 当氯离子质量浓度超过5 g/L 时，渗透压增大，细胞因失水发生质壁分离，活性降低，严重时微生物死亡。NaCl 质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响如图3 所示。

图3 NaCl 质量浓度对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig. 3 Influence of NaCl content on cell concentration and oil removal rate

随着NaCl 质量浓度升高，OD600和菌体质量浓度分为2 个阶段：当NaCl 质量浓度从5 g/L 升高到20 g/L 时，OD600和菌体质量浓度逐渐下降，但变化幅度不大，分别从2.710 和4.40 g/L 降低至2.578和4.10 g/L，降低了4.9%和6.8%；其中NaCl 质量浓度为10 g/L 时，OD600和菌体质量浓度最高，说明10 g/L 的NaCl 质量浓度有利于微生物的生长繁殖。 当NaCl 质量浓度逐渐升高时，OD600和菌体质量浓度下降幅度增大，NaCl 质量浓度为30 g/L 时，OD600为2.274，菌体质量浓度为2.05 g/L，与NaCl 质量浓度为20 g/L 相比，分别下降了16.1%和53.4%；当NaCl 质量浓度增大到90 g/L 时，OD600和菌体质量浓度分别下降了51.7%和70.5%。 可见NaCl 质量浓度或渗透压过高或过低，微生物的生长活性均受到抑制[19]。

2）在含水土体中进行隧洞施工前，地质勘探尤为重要。土质、含水（尤其是水量、水压力）状况等应作为重点指标进行勘察。对水量丰富、渗流稳定的地下水处理往往选用洞内排水措施是不明智的。

由图3（b）可以看出，NaCl 质量浓度对乳化油脂能力和除油率的影响与菌体生长情况相近，即NaCl 质量浓度为5~20 g/L 时，乳化油脂的能力和除油率先升高后降低，并在10 g/L 时取得最大值，为0.567 和84.75%；当NaCl 质量浓度超过30 g/L 时，随着NaCl 质量浓度升高，乳化油脂能力和除油率明显降低；当NaCl 质量浓度为90 g/L 时，乳化油脂能力和油脂去除率分别降低至0.313 和43.87%，与NaCl 质量浓度5 g/L 时相比，降低了41.7%和46.49%。 屈瑾等的研究表明当NaCl 质量浓度过高时，外界渗透压高会抑制微生物活性[20]，使得微生物产酶能力下降、脂肪酶活性降低、除油效果变差。

2.4 油脂质量分数对除油菌生长及油脂去除的影响

图4 为油脂质量分数对除油菌生长及油脂去除的影响。

图4 油脂质量分数对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig. 4 Influence of oil concentration on bacterial cell concentration and oil removal rate

可以看出，随着油脂质量分数升高，OD600和菌体质量浓度先升高后缓慢降低。 当油脂质量分数从1%升高到2%时，菌体生长情况得到改善，OD600和菌体质量浓度分别为2.442 和4.30 g/L，提高了15.5%和87%。 此后随着油脂质量分数升高，OD600和菌体质量浓度逐渐降低，至5%时，分别降低了10.6%和48.8%。 该体系中，油脂是微生物生长的唯一碳源，质量分数过低或过高均不利于微生物生长，复合除油菌剂在油脂质量分数为2%的条件下，生长最好；当油脂质量分数为1%时，提供的碳源不足以满足除油菌的生长需要，当油脂质量分数高于3%时，油脂质量分数过高，其在液体表面形成油膜，阻碍了微生物生长所需氧气的传递，微生物生长受到一定程度的抑制。

从图4（b）可以看出，除油菌乳化油脂能力和除油率的变化趋势与菌剂生长特别是OD600的变化情况一致，即当油脂质量分数为2%时，乳化油脂能力和除油率最佳，达0.567 和84.49%；油脂质量分数为1%时，乳化油脂能力和除油率大大降低，高于2%时，也出现不同程度的下降。 通常随着油脂质量分数升高，水中溶解氧质量浓度降低，微生物生长和活性受到抑制、产酶能力下降、乳化能力降低，不利于油脂的降解去除，该结果与柯霞等的研究结果一致[21]。

另外，当油脂质量分数升高到5%时，OD600和菌体质量浓度分别为2.181 和2.2 g/L，乳化油脂能力和除油率分别为0.501 和55.07%，均高于油脂质量分数为1%时的情况，说明该复合除油菌剂对油脂质量浓度的适应范围较广，可在较宽的油脂质量浓度范围内稳定生长，可用于油脂质量浓度较高的餐厨垃圾或废水的发酵过程。

2.5 接种体积分数对除油菌生长及油脂去除的影响

复合除油菌剂的接种体积分数对其生长情况及油脂去除的影响见图5。

图5 接种体积分数对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig. 5 Influence of inoculation amount on cell concentration and oil removal rate

可以看出，随着菌剂接种体积分数的增加，菌体生长情况先得到改善而后转而下降，当菌剂接种体积分数为5%时，生长情况最好，OD600和菌体质量浓度分别为2.632 和7.45 g/L。当菌剂接种体积分数低于5%时，一定培养时间内，相对较少的除油菌无法较好乳化和降解相对较多的油脂，OD600和菌体质量浓度下降明显，当菌剂接种体积分数为1%时，分别降低了7.4%和17.4%。 菌剂接种体积分数高于5%时，体系内提供碳源不足，同时前期菌体快速生长引起溶解氧不足，菌体生长情况由此受到不同程度的抑制。

由图5（b）可以看出，该菌剂的乳化油脂能力及除油率的变化与其生长情况一致，接种体积分数为5%时，菌体质量浓度高，产生的脂肪酶多，乳化油脂能力和除油率最高，分别为0.539 和81.78%。 在菌剂接种体积分数为1%~9%时，最终油脂去除率都可以达到70%以上，当接种体积分数大于5%时，除油率下降，可能是由于可利用的总溶解氧不足及营养物质被消耗所致[22]。

2.6 单一菌株的产脂肪酶能力

微生物降解油脂的能力与脂肪酶的酶活有关，随酶活升高，油脂降解能力提高。 各除油菌株所产脂肪酶的酶活及除油率随处理时间的变化情况见图6。

图6 除油菌所产脂肪酶的酶活随时间的变化情况Fig. 6 Changes of lipase activity produced by degreasing bacteria over time

随着处理时间的延长，脂肪酶的酶活先升高后降低。 处理至36 h 时，菌株B501、菌株009、菌株005 和菌株B409 所产脂肪酶的酶活均达到最高，分别为6.58、6.28、5.58、4.92 U/mL，其中，菌株B501 的产脂肪酶能力最强。 处理至48 h 时，菌株009 所产脂肪酶的酶活最高，为6.18 U/mL，且远高于其他3株微生物，说明菌株009 持续产脂肪酶的能力较强。 各单菌株除油结果表明，与其他3 株微生物相比，菌株009 的除油率最高，为70.98%，这与其持续产脂肪酶能力较强有关。 菌株B501 和005 的除油率分别为63.58%和66.03%，菌株B409 的除油率最低，为44.56%。

3 结 语

所得复合除油微生物菌剂的除油效果受温度、pH、NaCl、油脂质量浓度和接种体积分数的影响较大，较佳除油条件为：温度35 ℃，pH 9，含盐量10 g/L，油脂质量分数2%，菌体接种体积分数5%，除油率最高可达84.75%。单一菌株产脂肪酶的酶活及除油率的研究结果表明，各菌株在36 h 时的产脂肪酶能力较强，此时菌株B501 的脂肪酶酶活最高，为6.58 U/mL，而菌株009 所产脂肪酶处于高酶活的持续时间较长，因此除油率最高，达70.98%。与单一菌株相比，复合除油微生物菌剂的除油率有所提高。