N端非催化结构域对微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响

黄小艺，李鹤宾，陈艳红,3,4，姜泽东,3,4，倪 辉,3,4，李清彪,3,4，朱艳冰,3,4,

（1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.厦门医学院药学系，福建 厦门 361023；3.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；4.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021）

褐藻是一种广泛分布在海洋生态系统中的大型藻类。褐藻胶是褐藻细胞壁中一种主要的线性多糖，占褐藻干质量的40%[1]。褐藻胶由D-甘露糖醛酸（β-Dmannuronic acid，M）和L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通过1,4-糖苷键连接形成[2]。研究发现，褐藻胶降解成褐藻胶寡糖后，生物利用性和生物活性显著提高，包括抗凋亡、抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗菌和抗氧化等[3]。利用酶法制备褐藻胶寡糖具有反应特异性高、反应条件温和、降低环境污染等优点，在褐藻胶寡糖的制备中更具有优势[4]。

褐藻胶裂解酶通过β-消除机制作用于褐藻胶的1,4-糖苷键，最终在产物末端六元环C4和C5位生成不饱和双键，产生非还原端不饱和的褐藻胶寡糖[5-6]。褐藻胶裂解酶来源广泛，包括细菌、真菌、病毒和软体动物[5]。根据一级结构差异，褐藻胶裂解酶可分为15 个多糖裂解酶家族；根据裂解方式不同，可分为内切型和外切型褐藻胶裂解酶；根据底物特异性，可分为D-聚甘露糖醛酸钠（polyM）偏好型、L-聚古罗糖醛酸钠（polyG）偏好型和双功能型褐藻胶裂解酶[7]。褐藻胶裂解酶的酶学性质与其来源生物体和生存环境有一定关系[1]，非催化结构域可能影响褐藻胶裂解酶的催化性质[2,8]。与其他多糖裂解酶一样，褐藻胶裂解酶是一种包含催化和非催化多结构域的裂解酶。褐藻胶裂解酶常见的非催化结构域包括碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding module，CBM）[9-10]和F5/8 C型结构域。通常来说，催化结构域在识别、结合、降解底物方面扮演重要角色[11]，而非催化模块影响酶的生化特性[12]。

大多数褐藻酸裂解酶的活性和稳定性较低[13]，限制了该酶的广泛应用。褐藻胶裂解酶非催化结构域的截短或重组可能改良酶催化性质[7,14-16]。研究组前期从腐烂的海带中分离得到海洋微泡菌ALW1（Microbulbifersp.ALW1）[17]，基因组分析发现含有1 个预测为PL7家族的褐藻胶裂解酶AlgL7的编码基因，该酶包含2 个非催化模块CBM和F5/8 C型结构域。为了解该酶非催化结构域的功能，通过基因截短、蛋白质表达和纯化，研究非催化模块对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响，旨在解析该酶非催化结构域与酶性质的构效关系，为酶的实践应用提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微泡菌ALW1、大肠杆菌BL21（DE3）为本实验室保存。

海藻酸钠、polyM、polyG 国药集团化学试剂有限公司；EcoRI、BamHI、XhoI、T4DNA连接酶日本TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、卡那霉素生工生物工程（上海）股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂、2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（bicinchoninic acid kit，BCA）试剂盒厦门市淘烁生物科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow美国GE Healthcare Life Sciences公司；其他化学试剂均为分析纯产品。

1.2 仪器与设备

Sorvall LYNX 4000高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；恒温振荡摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；水浴锅 冠森生物科技有限公司；Epoch2T微量酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪伯乐生命医学产品有限公司；鼓风干燥箱 深圳市爱特尔电子科技有限公司；核酸电泳仪 美国GE Healthcare Life Sciences公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻胶裂解酶AlgL7的生物信息学分析

利用ExPAsy网站中ProtParam工具对褐藻胶裂解酶AlgL7的氨基酸组成、理论分子质量和等电点等理化性质进行预测。使用Clustal X2进行多序列比对，MEGA 11.0软件构建褐藻胶裂解酶AlgL7的系统发育树。利用NCBI的保守结构域模块进行蛋白质的结构域分析。

1.3.2 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体基因工程菌株构建

参照细菌基因组提取试剂盒方法提取菌株ALW1的基因组DNA，以该基因组为模板，基于AlgL7保守结构域的预测结果，利用PCR分别扩增褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体（包括CD1和CD2）基因，引物序列如表1所示。获得PCR产物后，CD1基因利用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切，AlgL7和CD2基因利用EcoRI和XhoI进行酶切，然后利用T4DNA连接酶分别将目的基因连接到pET-28a载体后，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。利用含卡那霉素的平板筛选和菌落PCR鉴定后，重组质粒送至厦门铂瑞生物科技有限公司测序。

表1 用于扩增AlgL7及其截短体的引物Table 1 Primers used for the amplification of AlgL7 and its truncations

1.3.3 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的表达与纯化

将测序成功的褐藻胶裂解酶AlgL 7 及其截短体基因工程菌株按1%接种量接种至LB液体培养基（含50 µg/mL卡那霉素），37 ℃、180 r/min过夜培养，当OD600nm值达到0.6～0.8后加入IPTG（终浓度0.1 mmol/L），16 ℃诱导表达18～24 h。将发酵液4 ℃、5000×g离心10 min，弃上清液，加入缓冲液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、30 mmol/L咪唑，pH 8.0）悬浮菌体，在冰浴条件下进行超声破碎，条件为超声5 s、间隙5 s，总时间15 min，功率300 W。将处理液4 ℃、12000×g离心20 min，得到粗酶液。参照Ni Sepharose 6 Fast Flow使用说明书，利用亲和层析对重组酶进行分离纯化。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析目的蛋白的纯度和分子质量，利用BCA试剂盒进行蛋白质定量。

1.3.4 褐藻胶裂解酶活力的测定

采用DNS法[18]。反应体系为5 μL酶液（0.11 mg/mL）加入200 μL 5 mg/mL海藻酸钠底物溶液（溶于50 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH 7.0），在最适温度下温浴15 min后，加入200 μL DNS试剂，沸水浴10 min，冷却至室温后，利用酶标仪在波长540 nm测定吸光度。褐藻胶裂解酶的活力定义为：在一定条件下，每分钟生成1 μmoL还原糖所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。

1.3.5 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的底物特异性

分别配制质量浓度为5 mg/mL海藻酸钠、polyM、polyG溶液测定重组酶的活力，研究褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的底物特异性。不同的底物与酶在最适温度下孵育15 min后，利用DNS法测定酶活力。

1.3.6 温度对褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体活性和稳定性的影响

在不同温度（20～60 ℃）下分别测定褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的活力，研究酶的最适反应温度。分别将褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体在不同温度（20～40 ℃）下放置15 min后，立即置于冰浴5 min，测定酶的残余活力，研究酶的温度稳定性，以未经热处理的酶活力为100%。

1.3.7 pH值对褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体活性和稳定性的影响

在不同pH值条件下分别测定褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的活力，研究酶的最适反应pH值。分别将褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体在不同pH值条件下25 ℃处理30 min后，测定酶的残余活力，研究酶的pH值稳定性，以未经处理的酶活力为100%。所用缓冲液为50 mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液（pH 3.0～6.0）、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.0～9.0）和甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0～11.0）。

1.3.8 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的动力学参数测定

在不同海藻酸钠底物质量浓度（0.5～5 mg/mL）下测定褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的活力，利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算酶的米氏亲和常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。

1.3.9 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的酶解产物鉴定

50 mL 5 mg/mL海藻酸钠、polyG和polyM不同底物溶液中分别加入3 U褐藻胶裂解酶，于30 ℃条件下反应，每小时取样一次，利用DNS法测定还原糖的释放量；孵育8 h后，向反应混合液中添加3 U褐藻胶裂解酶，继续反应9 h，还原糖的释放量不再发生变化时，将反应物沸水浴灭活10 min，4 ℃、11100×g离心20 min，收集上清液。加入3 倍体积无水乙醇，4 ℃静置2 h后，4 ℃、18000×g离心20 min，取上清液，冻干得到褐藻胶寡糖产物。参照Li Zhipeng等[19]报道的液相色谱-质谱方法鉴定酶解产物。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 褐藻胶裂解酶AlgL7的序列分析

微泡菌ALW1的褐藻胶裂解酶AlgL7基因（GenBank收录号OM831233）有1893 个碱基对，预测编码630 个氨基酸残基的蛋白质，理论等电点（pI）为4.40，理论分子质量为71.5 kDa。系统发育分析显示，AlgL7与来自PL7家族的褐藻胶裂解酶处于同一分支（图1a），表明该褐藻胶裂解酶属于PL7家族。保守结构域分析显示，AlgL7含有CBM结构域（Ile55～Tyr158）、F5/8 C型结构域（Ala202～Val322）和C端催化结构域（Phe364～His630）（图1b）。C端催化结构域命名为CD1，包含F5/8 C型结构域和C端催化结构域的截短酶命名为CD2（图1b）。此外，序列比对确定了微泡菌ALW1来源的AlgL7中含有QIH（Gln497～His499）、RTELREMLR（Arg428～Arg436）和YFKAG（Tyr600～Gly604）3 个保守区域，推测它们与促进底物识别和酶功能有关[20]。

图1 褐藻胶裂解酶AlgL7的系统发育（a）和结构域（b）分析Fig.1 Phylogenetic analysis (a) and domain analysis (b) of alginate lyase AlgL7

2.2 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的表达与纯化

成功构建了AlgL7、截短体CD1和CD2的基因工程菌株，利用IPTG进行诱导表达后，进行重组蛋白的纯化，SDS-PAGE分析显示，目的蛋白成功纯化，AlgL7、CD1和CD2的分子质量分别约为71.5、32.0 kDa和60.0 kDa（图2a），与蛋白质的理论分子质量吻合。酶活力分析结果表明，以海藻酸钠为底物，AlgL7、CD1和CD2的比活力分别为125.1、125.9 U/mg和183.9 U/mg（图2b）。AlgL7和CD2的酶活力相比，CBM结构域截短会显著增强酶的催化活性，CD2是AlgL7全长酶活力的1.47 倍，来自Vibrio natriegensSK42.001褐藻胶裂解酶Aly01FL的CBM截短体也显示出类似酶活力增强的现象[21]，来自Marinimicrobiumsp.H1褐藻胶裂解酶AlgH-I的CBM截短体显示出酶活力降低的影响结果[16]。CD1和CD2酶活力相比，F5/8 C型结构域截短会降低酶的催化活性，Flammeovirgasp.MY04来源褐藻胶裂解酶Aly5的F5/8 C截短体对海藻酸钠的酶活力也低于野生型酶[22]，说明F5/8 C型结构域在维持酶活力方面具有重要作用。催化活性是酶应用的一个重要指标，高活性褐藻胶裂解酶在工业上具有更大的应用价值。

图2 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的SDS-PAGE（a）和酶活力（b）分析Fig.2 SDS-PAGE (a) and enzymatic activity (b) analysis of alginate lyase AlgL7 and its truncations

2.3 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的底物特异性

利用海藻酸钠、polyM和polyG 3 种多糖作为底物进行酶的底物特异性研究。如图3所示，AlgL7、CD1和CD2对海藻酸钠、polyM和polyG 3 种底物均有活性，说明非催化结构域CBM和F5/8 C型结构域未影响酶的底物特异性，它们对底物的催化活性不是必需，这与Yan Junjun等[16]报道的结果类似，底物特异性并没有因为删除CBM和F5/8 C型结构域而发生变化。另外，与AlgL7相比，CD2对ployG的酶活力显著提高，CD1和CD2对polyM的酶活力显著降低，CD2对海藻酸钠的酶活力显著提高，说明非催化结构域CBM和F5/8 C型结构域影响了酶对不同底物的催化活性。

图3 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的底物特异性Fig.3 Substrate specificity of alginate lyase AlgL7 and its truncations

CBM为碳水化合物活性酶内的连续氨基酸序列，大多数独立形成β-三明治形状的折叠区，参与酶与底物的结合与识别，以及产物的释放[23-24]。与本研究结果不同，来自Agarivoranssp.L11褐藻胶裂解酶AlyL2的CBM13使该酶易于降解M-block底物[25]。与本研究结果类似，来源于Vibrio natriegensSK42.001褐藻胶裂解酶Aly01FL的CBM模块缺失导致酶对PolyM催化活性降低[21]。本研究中，去除CBM结构域的CD1和CD2截短酶对polyM酶活力显著降低（图3），说明非催化结构域CBM可能影响了AlgL7对PolyM底物的结合与识别。据报道，PL7家族褐藻胶裂解酶的底物特异性与保守区的蛋白质序列有关[26]。PL7家族的褐藻胶裂解酶包含3 个高度保守的区域（R/E）（S/T/N）EL、Q（I/V）H和YFKAG（V/I）YNQ，这些保守区域形成了β-三明治形状的空腔结合底物。本研究中，褐藻胶裂解酶AlgL7包含QIH保守结构域，是一个对polyM和polyG都起作用的双功能褐藻胶裂解酶。

F5/8 C型结构域被称为discoidin（DS）结构域，它可以通过增强酶与底物的相互作用能提高糖苷水解酶的水解活性[27]。本研究中，与CD2相比，去除F5/8 C型结构域的CD1截短酶对PolyG和海藻酸钠的酶活力显著降低（图3），说明F5/8 C型结构域可能影响了AlgL7对PolyG底物的相互作用。

2.4 温度对AlgL7及其截短体活性和稳定性的影响

如图4a所示，AlgL7和CD2在40 ℃时催化活性最高，CD1的最适反应温度为30 ℃，说明CBM对酶的最适反应温度无影响，F5/8 C型结构域去除降低了酶的最适反应温度。大部分PL7家族褐藻胶裂解酶的最适反应温度为30～45 ℃，例如Serratia marcescensNJ-07来源褐藻胶裂解酶AlgNJ-07[28]、Flammeovirgasp.strain MY04来源褐藻胶裂解酶Aly2[29]和Vibrio furnissiiH1来源褐藻胶裂解酶AlyH1[30]的最适反应温度均为40 ℃。根据Meng Qing等[21]的研究报道，移除CBM结构域并不改变褐藻胶裂解酶Aly01的最适反应温度。而褐藻胶裂解酶AlyL2中，截短CBM13结构域，酶的最适反应温度降低了10 ℃[25]。另外，与本研究结果类似，来自Flammeovirgasp.MY04褐藻胶裂解酶Aly5中F5/8 C型结构域的去除降低了酶的最适反应温度[22]，表明F5/8 C型结构域在酶的生化特性中与酶最适反应温度紧密相关。

图4 温度对褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体酶活力（a）和稳定性（b）的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity (a) and stability (b) of alginate lyase AlgL7 and its truncations

如图4b所示，相较于AlgL7，截短酶CD2的热稳定性显著增强，在20～35 ℃下孵育15 min，残余酶活力保持在45%以上，表明非催化结构域CBM的截短提高了酶的热稳定性。截短褐藻胶裂解酶的非催化结构域后，该酶可能具有紧凑的三维结构，更有利于抵抗热变性条件[7]。与本研究结果不同，褐藻胶裂解酶AlyL2的CBM提高了酶热稳定性[25]。另外，在20～35 ℃范围内，截短酶CD1的温度稳定性低于截短酶CD2，说明F5/8 C型结构域的去除降低了酶的温度稳定性。酶的温度稳定性提高有利于酶的工业应用[31]。

2.5 pH值对AlgL7及其截短体活性和稳定性的影响

如图5a所示，AlgL7及其截短体的最适反应pH值均为7.0，说明CBM和F5/8 C型结构域对酶的最适反应pH值无影响。褐藻胶裂解酶AlgH结构中F5/8 C型结构域也不改变酶的最适反应pH值[16]。如图5b所示，截短体CD2在pH 3.0～6.0和8.0～11.0范围内的pH值稳定性高于AlgL7，表明CBM的去除提高了酶在酸性和碱性条件下稳定性。对褐藻胶裂解酶AlyL2-FL去除C端的CBM结构域，最适反应pH值由8.6降低至7.0，在pH 3.0～6.0范围内去除CBM的截短体保留酶活力远低于原始型酶。对褐藻胶裂解酶VxAly7B去除N端的CBM结构域，酶的最适反应pH值提高了0.6，在pH 3.0～6.0范围内残余酶活力略高于原始型酶[32]。另外，本研究中截短酶CD2相较于CD1在pH 3.0～6.0和10.0～11.0范围内pH值稳定性高于CD1（图5b），表明F5/8 C型结构域提高了酶在酸性和碱性条件下的稳定性。

图5 pH值对褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体酶活力（a）和稳定性（b）的影响Fig.5 Effects of pH on the activity (a) and stability (b) of alginate lyase AlgL7 and its truncations

2.6 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的动力学参数

如表2所示，以海藻酸钠为底物，AlgL7的Km和Vmax值最低，CD2的Km和Vmax值最高，表明CBM结构域降低了酶的最大反应速率，但提高了酶与底物之间的亲和力，促进AlgL7与海藻酸钠的结合；F5/8 C型结构域提高了酶的最大反应速率，但降低了酶与底物之间的亲和力。相似的研究结果出现在Marinimicrobiumsp.H1来源褐藻胶裂解酶AlgH中，不含CBM的截短酶Km和Vmax值增大[16]。然而，在不同褐藻胶裂解酶中，CBM表现出不同的影响，例如CBM32降低了褐藻胶裂解酶VxAly7B对海藻酸钠的亲和力[32]。

表2 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体对海藻酸钠的动力学参数Table 2 Kinetic parameters of alginate lyase AlgL7 and its truncations on sodium alginate

2.7 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体的酶解产物分析

利用液相色谱-质谱分析AlgL7、CD1和CD2降解海藻酸钠、polyG和polyM的终产物组成。如图6所示，AlgL7能够将海藻酸钠降解生成聚合度为2、3和4的寡糖，降解polyG和polyM的主要产物为二糖和三糖（图6a～c），表明AlgL7是一种内切型褐藻胶裂解酶。CD1和CD2降解海藻酸钠、polyM和polyG的产物均为二糖和三糖（图6d～i）。上述结果表明，CBM和F5/8 C型结构域对酶解产物没有显著差异，表明非催化结构域在底物降解模式中没有发挥重要作用。

图6 褐藻胶裂解酶AlgL7及其截短体酶解产物的质谱分析Fig.6 Mass spectra of the enzymatic hydrolysates obtained using AlgL7 and its truncations

3 结论

克隆表达了微泡菌ALW1来源的褐藻胶裂解酶全长酶AlgL7及其两个截短酶CD1（催化结构域）、CD2（包含F5/8 C型结构域和催化结构域）。酶学性质的比较分析显示，CBM结构域降低了酶的催化活性、热稳定性和Vmax值，但提高了酶与底物的亲和力；F5/8 C型结构域提高了酶的催化活性、最适反应温度、热稳定性和Vmax值，但降低了酶与底物的亲和力。截短体CD2的酶活力和热稳定性得到显著提高，能降解海藻酸钠生成聚合度低的褐藻胶寡糖二糖、三糖和四糖。本研究明确了非催化模块CBM和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响，获得了具有优良性质的截短酶CD2，扩大该褐藻胶裂解酶的应用范围。