加酶挤压预处理酿造土圞儿黄酒及其品质分析

焦爱权,边士超,金征宇*

1(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学),江苏 无锡,214122)2(江南大学 食品学院,江苏 无锡,214122)

土圞儿(ApiosfortuneiMaxim)又名罗汉参、香芋,是一种豆科多年生草本植物[1]。土圞儿块根呈圆球形或不规则长圆形,长2～8 cm,其土黄色表皮上有断续的环状纹理,内部肉质洁白细嫩。土圞儿块根是一种中华传统药材,在《本草拾遗》等多本古籍中皆被作为重要药材记载[2]。然而,多年来因种植难、产量低以及种植方式较为粗放等因素制约了土圞儿的快速发展,自近年来土圞儿在山东单县得到规模化种植,其相关研究以及产业才逐渐得到发展。土圞儿块根中含有丰富的蛋白质、碳水化合物和矿物质[3-4],是一种兼具药用和食用价值的作物,近年来还被入选国家地理保护产品以及国家道地药材。然而由于土圞儿的发展时间较短,开发程度较低,当前土圞儿以销售鲜品为主,产品形式单一,尤其缺少高附加值产品。考虑到土圞儿具有潜在保健功效,且富含淀粉[5],将其应用于黄酒酿造,开发具有潜在保健功效的新型黄酒可以丰富其产品形式并提升产品附加值。

传统的黄酒是以去壳后的大米、黍米等为原料,经浸泡、蒸煮等预处理后辅以麦曲、酵母以及适量的水,经过长时间的微生物发酵及谷物降解后酿造得到。实际上,黄酒酿造的原辅料选择极其丰富,淀粉含量高的原料都可以用来酿酒,不同原辅料的选择将会直接影响最终黄酒的风味以及品质,从而得到各种独具风味的新型黄酒[6-7]。GB/T 13662—2018《黄酒》中则将由于原辅料或是工艺的改变,具有特殊风味且不改变黄酒风格的酒定义为特型黄酒。传统黄酒酿造通常采取浸泡加蒸煮的方式来熟化原料,效率低且会造成环境污染[8-10]。随着科技的进步,以及在时代的需求下,挤压、焙炒、液化、生料以及加酶挤压等新工艺蓬勃发展[10]。其中,加酶挤压指在传统挤压过程中引入外源酶。挤压腔内高压、高剪切的特殊环境赋予酶更高的催化活性,还具有高效、绿色、可连续化生产等优点,尤其在处理天然生物大分子的改性和降解方面具有突出优势[11]。目前加酶挤压已应用于谷物的熟化和降解,进行黄酒、啤酒等产品的酿造[12-13]。

基于上述背景,本研究拟将加酶挤压技术应用于土圞儿的预处理来酿造黄酒,并与其他熟化方式[传统挤压(不加酶)和传统蒸煮]对比,通过分析成品土圞儿黄酒的品质和风味,发掘其扩充黄酒品类的潜力,研究结果可以为土圞儿黄酒的酿造提供指导,以促进土圞儿高附加值产品的开发。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料与试剂

土圞儿全粉,山东单县天翔罗汉参专业合作社,基本组成为:淀粉(67.7±1.8)%,蛋白质(14.9±0.5)%,水分(11.2±0.3)%,粗纤维(3.4±0.2)%,灰分(3.3±0.1)%,脂质(2.3±0.0)%;耐高温α-淀粉酶(Termamyl SC 120L),诺维信公司(120 KUN/g);Taka-淀粉酶(1.2～1.8 U/mg)、色谱实验用试剂,2-辛醇(色谱纯),其他试剂为分析纯,国药公司;黄酒酿造用麦曲,上海金枫酒业股份有限公司;酵母,安琪酵母股份有限公司;无锡黄酒、锡山特黄以及绍兴女儿红,市售。

1.1.2 实验仪器

FMHE36-24型双螺杆挤压机,湖南富马科食品工程技术有限公司;RQH-150型智能人工气候培养箱,郑州生元仪器有限公司;1100型高效液相色谱仪,美国Agilent公司;Stater5000型pH计,美国Ohaus公司;Pegasus HRT+4D型全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱仪,美国LECO公司;Supernose(气体指纹分析)全自动电子鼻,美国ISENSO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 加酶挤压工艺参数的优化

加酶挤压相较于蒸汽蒸煮等预处理方式,其主要优势在于能同时熟化和液化底物,挤出物的糊化度以及还原糖含量能较好地反映加酶挤压对淀粉熟化和液化的效果,同时也是影响后续发酵的重要因素,因此选择糊化度和还原糖含量作为响应参数。

1.2.1.1 糊化度的测定

采用酶法测定,参照YANG等[14]的方法。

1.2.1.2 还原糖含量的测定

定量称取1 g样品于50 mL离心管中,加入20 mL pH为3.5的0.2 mol/L CH3COONa缓冲液后混匀,室温(25 ℃)振荡(160 r/min)45 min后,用去离子水定容至50 mL,过滤取上清液。上清液中还原糖含量的测定参照MILLER[15]的方法。

1.2.1.3 单因素试验

以挤压机末区温度、挤压水分、螺杆转速以及加酶量进行单因素试验。探索挤压条件对糊化度和还原糖含量的影响规律。挤压温度:控制前4区温度为60、70、80、90 ℃,末区温度梯度设置为80、95、110、125、140 ℃;挤压水分梯度:30%、37.5%、45%、52.5%、60%;螺杆转速梯度:60、90、120、150、180 r/min;加酶量梯度:0.2‰、0.5‰、0.8‰、1.1‰、1.4‰。固定参数为:挤压末区温度110 ℃;挤压水分45%;螺杆转速120 r/min;加酶量0.8‰。

1.2.1.4 响应面实验

根据1.2.1.3节单因素试验结果,在更小的参数范围内构建响应曲面模型。具体设计方案如表1所示。

表1 响应面实验设计方案Table 1 Design scheme of response surface experiment

1.2.2 样品预处理

加酶挤压:在土圞儿粉预调湿过程中,先将耐高温α-淀粉酶溶于水中,再将含淀粉酶的水溶液与土圞儿原粉混合均匀,使最终原料含水量为25%(质量分数,下同),并在4 ℃冰箱中存放12 h以保证水分分布均匀,在挤压实验前2 h取出样品。最终以响应面优化后参数制备加酶挤压样品。传统挤压:除不添加耐高温α-淀粉酶外,其余操作同加酶挤压。传统蒸煮:先将土圞儿粉预调湿至水分含量为50%,然后用蒸汽蒸煮30 min,得到传统蒸煮样品。

1.2.3 土圞儿黄酒发酵实验

土圞儿样品(干重)、麦曲、酵母和水按照质量比1∶0.1∶0.001∶3.5的比例添加到500 mL的广口瓶中并充分搅拌、混合。发酵过程在人工气候调节箱中完成,包括前发酵(3 d,30 ℃)以及后发酵(10 d,15 ℃)。发酵完成后,在6 500×g下离心20 min得到酒液,并在85 ℃下加热15 min用于杀灭微生物和灭酶。处理完的酒液经过滤后密封保存于4 ℃环境中。

1.2.4 黄酒品质参数测定

1.2.4.1 酒精度、总酸、总糖、pH以及非糖可溶性固形物测定

黄酒中酒精度参照ZHAO等[13]的方法,通过密度瓶测定。黄酒中总糖含量的测定参照MILLER[15]的方法。总酸的测定参照GB/T 13662—2018《黄酒》中酸度的测定方法,使用NaOH溶液滴定。

1.2.4.2 氨基酸和γ-氨基丁酸含量测定

黄酒中游离氨基酸和γ-氨基丁酸的含量通过HPLC测定。采用ODS HYPERSILC18色谱柱(250 mm×4.0 mm,5 μm)。流动相A[V(27.6 mmol/L醋酸钠溶液)∶V(三乙胺)∶V(四氢呋喃)=1 000∶0.22∶5]和流动相B[V(80.9 mmol/L CH3COONa溶液)∶V(乙腈)∶V(甲醇)=200∶400∶400]用于梯度洗脱,流速1 mL/min。紫外检测器的检测波长为338 nm和262 nm(脯氨酸)。

1.2.4.3 多酚含量和抗氧化能力测定

多酚含量用福林酚试剂法测定,参照XU等[16]的方法。结果以没食子酸(gallic acid,GA)当量表示,单位为mg没食子酸当量每升黄酒样品(mg GAE/L)。抗氧化能力用DPPH自由基清除能力表征,参照XU等[17]的方法。抗氧化能力用Trolox当量表示(Trolox equivalent antioxidant capacity,TEAC),单位为mg Trolox当量每升黄酒样品(mg TEAC/L)。

1.2.5 黄酒风味分析

1.2.5.1 感官评定

黄酒的感官评定参照徐恩波[18]的方法,同时参照GB/T 13662—2018《黄酒》稍作修改,具体从外观(清亮透明～不透明,并描述颜色与瓶底聚集物情况)、香气(浓郁～较淡,并描述香气特征)、口味(爽口～不爽口,并描述口味特征)和风格(协调～不协调,并将风格分为清爽型和传统型)4个方面进行描述性分析,并最终表述黄酒的整体接受度(好～较差)。选择6名男性和4名女性参照上述描述方法进行为期2周的培训后对试验酒样进行感官评定。

1.2.5.2 电子鼻分析

准确量取5 mL样品于20 mL气相瓶中,用封口膜封好后在室温下放置40 min,随后进行检测。电子鼻参数设定为:空气流速1 L/min,测试时间120 s,每个样品测试结束后洗涤200 s。

1.2.5.3 挥发性风味组分和气味活度值分析

通过顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)结合GC-MS检测黄酒中具体挥发性风味物质。具体为:黄酒样品先经过滤(0.45 μm滤膜),取5 mL黄酒样品于20 mL气相瓶中,加入20 μL质量浓度为20.25 mg/L(甲醇溶解)的2-辛醇作为内标。HS-SPME实验方法:使用SPME三相萃取头(75 μm PDMS/DVB/CAR),在50 ℃水浴加热条件下顶空萃取30 min。

气质联用色谱条件:在一维模式下进行挥发性风味组分的测定,色谱柱为TR-FFAP(30 m×0.25 μm×0.25 mm)。进样口温度250 ℃,不分流进样。升温程序:起始温度40 ℃,保持3 min,随后以10 ℃/min速率升至230 ℃并保持6 min。载气为高纯氦气,流速1 mL/min。质谱条件:使用EI电离源,离子源温度210 ℃,传输线温度250 ℃,电离能量70 eV,发射电流1 mA。采集频率12 spectra/s,采集质量范围33～400 amu。

由于人体嗅觉对不同的风味物质有着不同的感知阈值,因此无法直接将黄酒中风味物质的浓度与人体感受相联系[19]。基于此,借助气味活度值(odor activity value,OAV)来评估单一物质对黄酒整体风味的贡献情况。OAV通过黄酒中各挥发性香气成分质量浓度(ρ,mg/L)/香气成分在乙醇溶液中的气味阈值(T,mg/L)来计算(OAV=ρ/T)[20],通常认为OAV越大,则该物质对整体风味贡献程度越大。气体物质的OT值取自学术著作CompilationsofOdourThresholdValuesinAir,Water&otherMedia[21]和在线数据库TRISKELION VCF(Volatile Compounds in Food),对于香气的描述取自相关文献和数据库[19-22]。

1.2.6 数据处理及分析方法

借助Design Expert 11软件设计响应面实验以及绘制3D曲面图,所有实验均重复3次,结果以平均数±标准差表示。采用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析,P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

挤压机末区温度的影响如图1-a所示。当温度从80 ℃升至95 ℃时,糊化度和还原糖含量显著升高,这是因为温度升高促进了糊化作用,又因为α-淀粉酶的最适温度为80～90 ℃,温度升高可能促进了酶解作用,使得还原糖含量增加;继续升高温度至140 ℃,糊化度缓慢从95%逐渐升高至接近100%,而还原糖含量维持在16%左右,这是因为虽然温度已明显超过淀粉酶最适温度,但淀粉酶在短时挤压过程中最高耐受温度为160 ℃左右,故仍能发挥酶解作用[11]。综上可知,α-淀粉酶在挤压机末区温度为100 ℃左右时能发挥较好的酶解活性,过高的温度对糊化和酶解作用的提升效果有限。挤压水分的影响如图1-b所示。随着挤压水分从30%升至52.5%,土圞儿糊化度从约80%显著提升至近100%;还原糖含量从原先的约9%显著提升至近19%。这是因为挤压水分增加,有利于淀粉吸收后受热糊化,且酶活性受环境水分影响,水分的增加激活了酶,使得挤压机内淀粉降解程度大幅提升[18]。当挤压水分从52.5%升至60%时,糊化度反而有轻微的下降,可能是因为过高的水分削弱了挤压腔内摩擦、剪切等作用,弱化了挤压-酶解协同作用,不利于淀粉的糊化[23]。综上,挤压水分在52.5%左右时对淀粉有较好的熟化和液化效果。螺杆转速的影响如图1-c所示。螺杆转速从60 r/min升至90 r/min时,糊化度和还原糖含量有明显提升,这是因为螺杆转速的提高,增加了剪切作用以及机械能的输入,促进了淀粉的糊化和降解[24]。而螺杆转速继续增大至120 r/min,糊化度和还原糖含量又有明显降低,这可能是因为螺杆转速增加还会缩短物料在腔桶内的滞留时间[7],使得物料受热作用和酶解作用的时间变短。综上,螺杆转速在90 r/min左右对土圞儿有较好的熟化和液化作用。酶添加量的影响如图1-d所示。随着酶添加量的增加,淀粉糊化度和还原糖含量不断增加,当酶添加量达1.4‰时,淀粉糊化度达到近100%,并且还原糖含量增加速度开始减慢,说明酶与底物作用逐渐趋于饱和。综上,酶添加量在1.1‰左右较为合适。

a-温度;b-水分;c-转速;d-酶量图1 挤压参数对土圞儿挤出物的影响Fig.1 Effect of extrusion parameters on enzymatically extruded A.fortunei

2.2 响应面实验结果

根据2.1节中单因素试验结果,确定了响应面各因素水平(表1),借助Design Expert 11软件进行Box-Behnken设计,具体设计方案以及试验结果见电子增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032892) 。

2.2.1 回归模型建立及分析

根据附表1中试验结果对数据进行多元回归方程拟合,可得到不同响应值(Y1-糊化度和Y2-还原糖)与各个因素之间的二次回归模型(编码方程),见公式(1)和公式(2)。

Y1=95.53+2.81A+1.77B-0.306 7C+1.43D-0.99AB+0.695AC-0.042 5AD+0.392 5BC-0.527 5BD+0.082 5CD-1.03A2-1.43B2-0.300 3C2+0.375 9D2

(1)

Y2=18.79+1.42A+1.15B+0.185 0C+1.28D-0.912 5AB-0.022 5AC+0.217 5AD+0.772 5BC-0.177 5BD+0.665 0CD-0.576 8A2-0.944 3B2-0.793 1C2-0.395 6D2

(2)

利用Design Expert 11软件对拟合方程进行方差分析,结果见电子增强出版附表2和附表3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032892)。

由附表2、3可知,糊化度和还原糖含量模型均拟合良好。并且根据F值可知,挤压参数对糊化度影响排序为:温度>水分>酶量>转速,其中,温度、水分、酶量对糊化度影响极显著(P<0.01),螺杆转速对糊化度影响较为显著(P<0.05)。对挤出物还原糖含量影响排序为:温度>酶量>水分>转速,其中,温度、水分、酶量对还原糖含量影响极显著(P<0.01),螺杆转速对还原糖含量影响不显著(P>0.05)。

2.2.2 最优工艺参数的确定

基于响应面试验结果,利用Design Expert 11软件优化得,在挤压末区温度104.9 ℃,挤压水分50.06%,螺杆转速96 r/min,加酶量1.40‰的条件下,预测得到最高糊化度和还原糖含量分别为98.89%和20.69%。考虑到实际操作情况,以挤压末区温度105 ℃,挤压水分50%,螺杆转速96 r/min,加酶量1.40‰(0.168 KNU/g),进行3次平行试验验证结果,得到挤出物实际的糊化度和还原糖含量测定值分别为98.67%和20.32%,与预测值较为接近,证明采用所建立模型得到的优化结果准确度高。

另外,传统挤压样品糊化度和还原糖含量为70.32%和5.61%;蒸汽蒸煮样品糊化度和还原糖含量为69.28%和5.53%。

2.3 黄酒品质参数分析

不同黄酒品质参数分析结果如表2所示。3种土圞儿黄酒中,加酶挤压预处理酿造得到的土圞儿黄酒有最高的酒精度。未经糊化的淀粉由于其高结晶度,对酶解有较高抗性[11],而加酶挤压样品糊化度最高,故其有最多可用来酶解并发酵的底物,因而酒精度最高。顺利的乙醇发酵确保了前期酵母菌的繁殖,从而会抑制一些对黄酒发酵不利的产酸菌的繁殖,这或许可以解释3种土圞儿黄酒中加酶挤压预处理酿造黄酒具有最低的总酸含量。一般而言,高温预处理(如蒸汽蒸煮)对植物原料中天然多酚有较大的破坏作用,相比蒸汽蒸煮,传统挤压处理过程中的高压、高剪切混合物理场使其对多酚具有更强的破坏作用[16],而淀粉酶的加入使得挤压过程中物料得以快速液化,并改善了剧烈的挤压环境,这间接保护了多酚物质,这或许可以解释加酶挤压土圞儿黄酒中具有最高的多酚含量。之前的研究表明,黄酒中多酚含量与其抗氧化性成正相关[17],然而,传统蒸煮土圞儿黄酒总酚含量低于加酶挤压土圞儿黄酒,却拥有最高的抗氧化性(116.88 mg TEAC/L),这或许是因为蒸汽蒸煮过程中产生了较多具有抗氧化性的美拉德反应产物。

表2 不同黄酒的品质参数分析Table 2 Analysis of quality characteristics of different Huangjiu products

相比于市售黄酒,3种土圞儿黄酒总酸含量稍高。另外,土圞儿黄酒中非糖可溶性固形物含量均显著高于市售黄酒。非糖可溶性固形物包括黄酒中各种营养物质,如肽类、氨基酸、多酚等,也是黄酒的一个重要评价指标[25]。此外,3种土圞儿黄酒氨基酸含量显著高于无锡老酒和锡山特黄,略低于女儿红。γ-氨基丁酸是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质,具有促进精神稳定、改善睡眠、降血压等功效[26]。3种土圞儿黄酒中γ-氨基丁酸显著高于3种市售酒,其中,加酶挤压土圞儿黄酒含量最高,为0.47 mg/L。土圞儿黄酒整体抗氧化性显著高于3种市售黄酒。以上品质参数分析证明土圞儿黄酒具有较好的营养价值,而其中又以加酶挤压预处理酿造得到的土圞儿黄酒品质最佳。

2.4 黄酒风味分析

2.4.1 感官评定结果

感官评定结果如表3所示,3种土圞儿黄酒色泽均偏橙黄色(未加焦糖色素),且带有花草清香,以及较淡的黄酒醇香(由麦曲带来的麦香和药香),酒体风格为偏向清爽型的特型黄酒。其中,传统蒸汽蒸煮以及传统挤压预处理酿造得到的黄酒感官评价不如加酶挤压土圞儿黄酒。3种市售大米黄酒因后期添加了焦糖色素,整体呈棕褐色,且都带有浓郁的黄酒醇香,酒体风格表现为典型的传统型黄酒风格。相较于工艺较为成熟的市售大米黄酒,土圞儿黄酒整体接受度上略有不足,但考虑到是以药材酿酒,同时综合品质参数分析结果,认为土圞儿黄酒在扩充黄酒品类方面具有一定潜力。

表3 不同黄酒的感官评定结果Table 3 Sensory evaluation results of different Huangjiu products

2.4.2 电子鼻分析结果

电子鼻利用气味传感器阵列来模拟人的嗅觉,可以排除不同人群感受气味时其主观感受对结果的影响。主成分分析(principal component analysis,PCA)是一种基于降维原则的分析方法,它可以使用少量的集成变量(即主成分)来表示多变量的复杂原始数据[22]。利用PCA处理电子鼻所测得数据,可以对黄酒风味进行分类。PCA结果如图2所示,第1主成分

图2 电子鼻检测不同黄酒所得结果的PCAFig.2 PCA of E-nose results from different Huangjiu products

(PC1)贡献率为84.5%,第2主成分贡献率为9.2%,总贡献率达92.23%,表明它们足以反映原始多指标的信息,且主要贡献集中在横轴方向[22, 27]。6种不同黄酒的整体区分性较好,传统挤压和蒸汽蒸煮酿造预处理两者酿造得到的土圞儿黄酒分布有部分重叠,无锡老酒和锡山特黄两者有部分重叠。3种土圞儿黄酒和3种市售黄酒分别位于横轴零刻度的两侧,说明3种土圞儿黄酒彼此间风味较为接近,且土圞儿黄酒与市售黄酒风味有着显著的区别[20]。

2.4.3 挥发性风味组分分析

利用GC-MS总共从6种黄酒中检测到了142种挥发性风味物质(具体信息见附表4)。为探究黄酒中对整体风味具有较大贡献的香气成分,从气质测得的挥发性风味物质中,计算并筛选了OAV>1的风味物质(关键香气成分),如表4所示。

表4 不同黄酒中挥发性风味物质的OAV对比Table 4 Comparison of OAV of the aroma-active compounds in different Huangjiu products

其中,具有果香的乙酸乙酯、乙酸异戊酯以及具有油脂香的异戊醇是6种黄酒所共有的关键香气组分,并且OAV均较高,对整体风味贡献较大。在3种市售黄酒中发现了若干种土圞儿黄酒不具备的关键香气组分,主要有带有果香味的3-甲基丁酸乙酯,带有大蒜味的二甲基三硫,以及果香味的2-甲基丁酸乙酯(主要在锡山特黄和女儿红中),其中,含硫化合物一般在传统黄酒中检测到的种类较少,浓度较低,但由于其较低的香气阈值以及较为强烈的风味,往往会加强黄酒整体风味的强度[19]。在3种土圞儿黄酒中则发现了芳樟醇、正辛醛、月桂烯和d-柠檬烯这4种市售黄酒不具备的关键香气组分,另外,具有蘑菇香的1-辛烯-3-醇(市售黄酒中仅无锡老酒中OAV>1,为1.1)以及具有花香的己酸乙酯(市售黄酒中仅女儿红中OAV>1,为1.5)也具有较高的OAV。其中具有铃兰香的芳樟醇在3种土圞儿黄酒中OAV均>300,是土圞儿黄酒中关键香气组分中OAV最大的风味物质。土圞儿黄酒和市售黄酒中关键香气组分的差别可能是造成两者整体风味具有较大差异的原因之一。

3 结论

本研究先将加酶挤压预处理应用于土圞儿黄酒发酵,通过与蒸汽蒸煮和传统挤压(不加酶挤压)预处理酿造得到的土圞儿黄酒进行对比发现,加酶挤压预处理酿造的土圞儿黄酒有最高的酒精度、总酚含量以及最低的总酸含量,具有最佳的品质参数。对比市售黄酒发现,土圞儿黄酒总酸含量稍高,而非糖可溶性固形物、氨基酸、以及γ-氨基丁酸含量以及抗氧化性均较高,证明土圞儿黄酒具有较好的营养价值。感官评定结果显示加酶挤压预处理酿造的土圞儿黄酒整体接受度尚好并且风味独特,上述实验证明加酶挤压预处理酿造得到的土圞儿黄酒在扩充黄酒品类方面具有一定潜力。