一株产纤维素酶菌株的分离纯化及其产酶性质研究

黄翠欣,张桂容,刘军,舒林,曹荣,温雪瓶,李丽,4*

1(四川轻化工大学 生物工程学院,四川 宜宾,644000)2(四川思来生物科技有限公司,四川 成都,610000)3(四川太源井醋业有限公司,四川 自贡,643000)4(固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川 宜宾,644000)

四川晒醋是麸醋的一类,以麸皮和大米为主要原料,用药曲做糖化剂,采取糖化、酒化、醋化同池进行的生料开放式多菌混合固态发酵工艺。经蒸煮、发酵、日晒(其醋醅和成品醋均经日光暴晒)、陈酿四大工艺流程,20多道工序,使得四川晒醋色泽黑褐、无沉淀、香气芬芳,具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠长、久存不腐的特点[1-2]。霉菌是食醋发酵过程中一类重要的微生物,包括毛霉、曲霉、青霉等,在发酵过程中不仅起着糖化、液化等作用,还与食醋风味、品质等紧密相关[3-4]。

在食醋酿造过程中,通过添加纤维素酶生产菌种可以提升食醋风味[5-6],微生物所产生的纤维素酶系是一个多组分酶系,通常将纤维素酶分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,可将纤维素水解成葡萄糖,用于生产乙醇、有机酸等化合物[7]。在这三类酶的协同作用下,纤维素可降解为葡萄糖,内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区,将纤维素切割成聚合度不同的短链纤维素;外切葡聚糖酶从短链纤维素的非还原端开始水解β-1,4糖苷键,释放纤维二糖;β-葡萄糖苷酶通过将纤维素二糖转化为葡萄糖来完成纤维素水解的最后一步[8-9]。

本研究从四川晒醋醋醅中分离得到一株能够产纤维素酶的菌株,结合生理生化试验和分子生物学手段鉴定为横梗霉菌(Lichtheimiaramosa),以内切葡聚糖、β-葡萄糖苷酶活力为指标,通过单因素试验、正交试验确定该菌的产酶条件及酶学性质,以期为后期横梗霉菌与四川晒醋风味物质形成的相关性研究提供理论依据,并为四川晒醋的生产提供了一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

醋醅,采集于四川某晒醋厂。

主要试剂:羧甲基纤维素钠、Na2SO3、乙酸、乙酸钠、葡萄糖(分析纯),成都科隆化学品有限公司;牛肉膏、蛋白胨(生化级),成都奥博星生物技术有限公司;酵母膏(生化试剂),上海展云化工有限公司;刚果红,天津市大茂化学试剂厂;水杨苷(分析纯),上海阿拉丁科技股份有限公司;琼脂(食品级),石狮市环球琼胶工业有限公司;马铃薯,市售。

T-114电子天平,奥豪斯仪器有限公司;QYC-2102C型恒温培养摇床,上海福马实验设备有限公司;BSG-24水浴锅、THZ-98C恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;T6紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;YXQ-75SII高压蒸汽灭菌锅,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;BM1000显微镜,南京江南永新光学有限公司;AT-710型pH计,日本京都电子制造有限公司;SW-CJ-1FD单人单面净化超净工作台,上海沪净医疗器械有限公司。

1.2 培养基

基础培养基(g/L):(NH4)2SO45,KH2PO41,MgSO4·7H2O 5,CaCl2·2H2O 0.1,酵母膏0.2,NaCl 0.1,碳源10(氮源5)。

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基、羧甲基纤维素钠培养基参考文献[10-11]配制;胰蛋白胨大豆肉汤(tryptose soya broth,TSB)培养基、明胶培养基、淀粉水解培养基参考文献[12]配制。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离鉴定

1.3.1.1 产纤维素酶菌株的筛选

取10 g醋醅投入盛有90 mL无菌水的三角瓶中,充分振荡后梯度稀释至10-1～10-6。取上述各梯度的稀释液100 μL涂布于PDA平板上,30 ℃倒置培养至长出单菌落。挑取单菌落点接于羧甲基纤维素钠培养基中,30 ℃恒温培养48 h后,倒入1 mg/mL刚果红溶液染色10 min,倒去刚果红溶液,向平板加入1 mol/L的NaCl溶液浸泡15 min脱色,观察菌落周围有无水解圈,并测量菌圈比,并且将产纤维素酶活力较强的菌株进行斜面保藏。

1.3.1.2 菌株形态观察

载片培养[13]后进行光学显微镜观察。

1.3.1.3 菌株的生理生化特性观察

根据《伯杰系统细菌鉴定手册》[14]和《微生物分类学》[15]对菌种进行碳氮源利用试验、温度耐受试验、盐耐受试验、明胶液化试验、淀粉水解试验。

1.3.1.4 菌株分子鉴定

采用DNA试剂盒对筛选到的菌株进行全基因组提取,以ITS1/ITS4进行PCR扩增,经纯化后送至上海派森诺生物科技有限公司测序。测序结果用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对,得到与待测物种序列相似性最大的物种信息,利用软件MEGA 6构建系统发育树。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 培养时间对横梗霉菌产酶能力影响

将菌株接种于PDA斜面培养基,于30 ℃培养48 h后,用无菌水洗脱孢子,调节稀释倍数,用血球计数板计孢子数,使生物量为3.5×106CFU/mL,再以5%(体积分数,下同)接种量接种于PDA发酵培养基,分别测定培养12、24、36、48、60、72 h后的纤维素酶活力。

1.3.2.2 接种量对横梗霉菌产酶能力影响

根据1.3.2.1节的测定结果,选择最优培养时间,在此培养时间条件下探索不同接种量(0.5%、1%、3%、5%、7%和9%)对产酶的影响。

1.3.2.3 反应温度对酶活力的影响

在确定接种量、发酵时间后,取粗酶液,设置不同的反应温度(4、30、40、50、60 ℃),比较反应温度对纤维素酶活性的影响。

1.3.2.4 pH值对酶活力的影响

在最适反应温度的基础上,设置不同酶反应体系pH值(3.0～10.0),测定不同pH值条件对纤维素酶活性的影响。

1.3.3 正交设计试验

在单因素试验基础上,选用培养时间、酶反应底物pH值、酶反应温度进行三因素三水平正交试验,分别测定内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力,酶活力单位为U/mL,内切葡聚糖酶活力正交设计见表1,β-葡萄糖苷酶活力正交设计见表2。取最佳组合条件做验证性试验,比较结果,确定最佳酶作用条件。

表1 内切葡聚糖酶活力因素水平表Table 1 factor levels of Endoglucanase activity

表2 β-葡萄糖苷酶活力因素水平表Table 2 factor level of β-glucosidase activity

1.3.4 酶活力测定方法

发酵液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液。

采用DNS法[16-17]测定酶活力:取3支干燥洁净的20 mL具塞刻度试管,分别在试管中加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL反应底物(内切葡聚糖酶活力测定采用羧甲基纤维素钠溶液;β-葡萄糖苷酶活力测定采用水杨苷溶液),同时另取一组已灭活的粗酶液作为空白对照。50 ℃水浴30 min后,立即向试管中各加入2 mL DNS溶液,充分摇匀后沸水浴5 min,冷却后用蒸馏水定容至20 mL,充分混匀。在540 nm波长下测定各试管溶液的OD值,根据葡萄糖标准曲线查相应的葡萄糖量,并计算相应的酶活力。

反应底物的制备:0.5 g羧甲基纤维素钠(即1.0 g水杨苷)定容到100 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2 mol/L pH 4.5)中。

在特定温度、特定pH值条件下,每分钟内催化底物产生1 μg还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U),计算如公式(1)所示:

(1)

式中:ρ,对照葡萄糖标准曲线得到的葡萄糖质量浓度,mg/mL;V0,反应体积,mL;t,反应时间,min;V,粗酶液体积,mL。

1.4 数据处理

实验均平行测定3次,数据以平均值±标准差表示,采用Excel软件处理数据,运用SPSS 22进行单因素ANOVA分析,并使用Duncan’s法进行多重比较,P<0.05表示差异显著,数值后标注不同小写字母表明差异性显著。正交试验结果采用极差分析法确定最优的组合。采用Origin 2021软件绘制柱状图,运用MEGA 6软件,Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株筛选结果

从晒醋醋醅中筛选出1株丝状真菌,命名为CPM,通过将单菌落点接于羧甲基纤维素钠琼脂培养基进行培养,并进行产纤维素酶活力检测,菌落1、2、3周围形成无色晕圈,如表3所示菌圈比分别为2.61±0.14、2.72±0.13、2.69±0.05,初步确定该菌具有降解纤维素的能力[18]。因此,选择该菌株进行后续实验。

表3 菌株菌圈比Table 3 Ratio of bacterial ring

2.2 菌株生理生化试验及形态特征结果

生理生化试验结果见表4,本研究选用12种碳源、11种氮源培养基培养菌株CPM,发现其均可利用;在30 ℃、37 ℃均能生长,但37 ℃下生长较为缓慢;该菌可在含有0～10% NaCl溶液的培养基中生长;可分解明胶、淀粉。

表4 生理生化试验结果Table 4 Physiological and biochemical test results

如图1-a所示,于PDA培养基30 ℃条件培养,48 h后菌落呈疏松的絮状,白色,边界不清晰;72 h后铺满平皿,成熟菌丝转变为黄色到不同程度灰色。

a-菌落形态;b-孢子囊及孢子形态图1 菌株CPM菌落、孢子囊及孢子形态Fig.1 Colony, sporangium and spore morphology of CPM strain

由图1-b可看出孢子囊表面光滑呈球形,孢子表面光滑呈椭圆形。根据文献[19-20]初步鉴定该菌为真菌界、毛霉门(Mucoromycota)、毛霉纲(Mucoraceae)、毛霉目(Mucorales)、横梗霉属(Lichtheimia)。

2.3 菌株分子生物学鉴定

建立系统发育树,比较菌株之间的同源性,如图2所示,菌株CPM与横梗霉菌(Lichtheimiaramosa)同源性较高。结合菌株形态学观察、生理生化分析,初步认定该菌为横梗霉菌(Lichtheimiaramosa)。

图2 菌株CPM的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain CPM

2.4 单因素试验结果

2.4.1 培养时间的优化

葡萄糖标准曲线测定结果得到线性回归方程:

y=1.454 6x-0.008,R2=0.999 1。如图3-a所示,菌株CPM的产酶效果和接种时间存在一定关系。接种量为5%,培养36 h时,内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力最高,分别为(76.86±0.43)、(44.55±0.22) U/mL。当培养时间<36 h时,随着培养时间的增加酶活力升高,而36 h后,酶活力下降,可能是由于培养时间较长,菌体老化,从而影响菌株的产酶能力[21]。

2.4.2 接种量的优化

如图3-b所示,菌株CPM的产酶效果在接种量为1%时,内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力均为最高,分别为(96.52±0.26)、(49.72±0.36) U/mL。当接种量大于1%时,酶活力下降,可能是由于接种量过高,培养基中菌浓度较大,经36 h后培养基中缺乏营养物质,使菌株代谢受阻,进而降低产酶效果[22]。

2.4.3 反应温度对酶活力的影响

由图3-c可知,在50 ℃条件下反应30 min时,该菌的内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力均为最高,分别为(97.85±0.92)和(49.22±0.61) U/mL;60 ℃条件下反应30 min仍有较高的酶活力,说明内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶有一定的耐高温特性,但是比50 ℃下的酶活力低,可见反应温度太高依然会降低酶活力;4 ℃反应30 min条件下酶活力最低,内切葡聚糖酶酶活力为(28.57±0.79) U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活力(19.91±0.55) U/mL,可见低温会抑制酶的活性。综上所述,内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50 ℃,且有较好的耐热性,耐高温这一特性与HONG等[23]研究结果一致。

2.4.4 pH值对酶活力的影响

过酸或过碱条件下都会影响纤维素酶的结构,从而降低酶的活力[24]。由图3-d可知,内切葡聚糖酶在pH 5.0时酶活力最高,为(96.72±0.83) U/mL,高于或低于pH 5.0酶活力均有所下降,说明该酶属于酸性酶,并且pH值范围在3.0～10.0均保持活性,说明菌株CPM所分泌出的内切葡聚糖酶具有良好的适应能力;pH 6.0时β-葡萄糖苷酶酶活力最高,为(51.07±0.83) U/mL,在pH值为3.0～10.0均保持活性,但是酸性条件下的酶活力均高于碱性条件,由此可知β-葡萄糖苷酶在酸性条件下的活力更高。

2.5 正交试验结果

内切葡聚糖酶活力正交试验结果如表5所示。经极差分析,可知对内切葡聚糖酶活力影响的主次关系为A>B>C,培养时间影响最大,其次是pH值和温度;通过比较均值K,得到最佳组合为A1B2C3,即培养时间24 h、反应底物pH 5.0、反应温度60 ℃;通过比较酶活力可知试验2的酶活力最大,达(95.92±0.99) U/mL。

β-葡萄糖苷酶活力正交试验结果如表6所示。经极差分析,可知对β-葡萄糖苷酶活力影响的主次关系为C′>A′>B′,温度影响最大,其次是培养时间和pH值;通过比较均值K,得到最佳组合为A′1B′1C′2,即培养时间24 h、反应底物pH 5.0、反应温度50 ℃;通过比较酶活力可知试验11的酶活力最大,达(47.57±3.66) U/mL。

表6 β-葡萄糖苷酶活力正交试验结果Table 6 Orthogonal test results of β-glucosidase activity

2.6 验证性试验

按正交试验结果,取最佳组合1(A1B2C3)测定内切葡聚糖酶活力,最佳组合2(A′1B′1C′2)测定β-葡萄糖苷酶活力,试验重复3次。结果如表7所示,正交试验2号的内切葡聚糖酶活力高于最佳组合1,正交试验11号的β-葡萄糖苷酶活力高于最佳组合2。故内切葡聚糖酶最优的酶作用条件为A1B2C2,即培养时间24 h、反应底物pH 5.0、反应温度50 ℃;β-葡萄糖苷酶最优的酶作用条件为A′1B′2C′2,即培养时间24 h、反应底物pH 6.0、反应温度50 ℃。

表7 验证试验结果Table 7 Results of verification test

3 结论

真菌产纤维素酶的主要特点是酶系全、产量高,并且能分泌到细胞外[25],横梗霉菌属于毛霉目的其中一种丝状真菌,可产生羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]、β-甘露聚糖酶[26]、淀粉酶[27]等。横梗霉菌在醋醅中比较少见,常存在于大曲中[28-29]。本文从四川晒醋醋醅中筛选出的1株能够产纤维素酶的横梗霉菌(Lichtheimiaramosa),通过单因素试验、正交试验探究其产酶条件与酶学性质。结果表明该菌所产的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分别在pH 5.0和pH 6.0条件下酶活力较高,具有较宽作用pH值和温度范围,对环境具有较强的耐受能力和适应性。后续还可以结合晒醋主料配方继续优化发酵底物,测定横梗霉菌在醋酸发酵过程中的代谢产物,这有助于横梗霉菌与四川晒醋风味物质形成的相关性研究。