青花菜转录因子BoiWRKY15的克隆及表达分析

徐谦，张圣美，黄宗安，钟伟杰，唐征

(温州科技职业学院/温州市农业科学研究院 浙南作物育种重点实验室 温州特色作物生物技术创新重点实验室，浙江 温州 325006)

青花菜(Brassicaoleracealvar.italica)又名绿菜花、木茎花椰菜，俗称西兰花，原产于地中海东部沿岸地区，为十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，一二年生草本植物。以肥嫩短缩的花枝和花蕾作为食用部分，营养丰富，风味极佳，且含有抗癌类芥子油苷[1]，已成为我国有发展前途的鲜用或加工出口创汇的重要蔬菜品种之一。近年来随着消费需求逐年增加，种植面积不断扩大，轮作倒茬时限逐渐缩短，黑腐病的危害呈逐年加重的趋势。十字花科黑腐病由革兰氏阴性植物病原菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.Campestris，Xcc)引起，是一种能使全球范围内所有十字花科植物形成黑腐病的重要病害[2]，染病后引起叶脉变黑、叶片枯死，影响植株光合作用，造成产量和花球品质的下降，对甘蓝类蔬菜的生产危害极大[3-4]。中国不是青花菜原产地，种质资源较为匮乏，抗病材料尤其稀缺，利用抗病相关基因培育新种质是解决这一问题的重要途径。

作为转录因子中的一大类，WRKY转录因子存在于所有的植物中，拟南芥(Arabidopsisthaliana)中有74个，水稻(Oryzasativa)中有109个，甘蓝(Brassicaoleracealvar．oleracea)中有148个成员[5-8]。WRKY转录因子参与植物的诸多生物学过程，在生长发育、非生物胁迫和生物胁迫的调控过程中起着重要作用[9]。WRKY转录因子参与病原菌的胁迫响应，例如，拟南芥中的AtWRKY38、AtWRKY46、AtWRKY53、AtWRKY54、AtWRKY62和AtWRKY70均参与植物对丁香假单胞菌的抗性调控[10-12]；结球白菜的8个成员在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)的侵染下差异表达，另有5个成员的表达受镰刀霉菌的诱导[13]；甘蓝型油菜中有21个WRKY基因响应根肿菌胁迫且在根肿病抗病和感病品种中差异表达[14]；芜菁BrWRKY46-2、BrWRKY70-2参与根肿菌响应过程，与芜菁品种抗病和感病密切相关并受水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)的强烈诱导[15]；青花菜中，BoWRKY2、BoWRKY3、BoWRKY6和BoiWRKY7的表达都受霜霉菌诱导升高，BoWRKY6过表达植株表现出对霜霉病的抗性，BoWRKY2和BoiWRKY7还分别受核盘菌和野油菜黄单胞菌诱导升高[16-18]。本研究以青花菜为材料，在克隆BoiWRKY15的基础上进行序列分析，利用荧光定量 PCR检测其组织定位与在野油菜黄单胞菌侵染下的表达，为将来开展该基因的功能研究和分子育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

以青花菜自交系青12为试验材料，于育苗大棚中培养至四叶一心期。采用喷雾法接种野油菜黄单胞菌，浓度为1×108CFU·mL-1，对照采用等量的无菌水。收集接种0、1、3、5和7 d时的叶片，用于RNA的提取。青12种子消毒后于MS培养基萌发生长7 d，幼苗分根冠取材、田间种植的青12植株于花期取花蕾、花和幼嫩角果用作组织表达分析。取材后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低温冰箱冷冻保存。幼苗叶片也用于基因组DNA的提取。

植物基因组DNA提取试剂盒、植物RNA提取试剂盒购自百泰克生物技术有限公司；Phanta®Max Super-Fidelity DNA聚合酶、5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit克隆试剂盒、Fast-T1感受态细胞、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA合成试剂盒、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix荧光定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。引物由华大基因合成。

1.2 DNA、RNA提取与基因克隆

按照试剂盒方法要求，提取纯化分离DNA和RNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

分别以青花菜基因组DNA和cDNA为模板，5′-ATGGCGGTGGAGCTCATGA-3′和5′-TCAAGACG ATTCCAAAATGAG-3′为上游与下游引物，引物用无菌水配制成浓度为10 μmol·L-1的溶液备用。目标基因的扩增体系为50 μL，包括 5×SF Buffer 10 μL，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)，上下游引物各2 μL(10 mmol·L-1)，1 μL模板和1 μL Phanta Super-Fidelity DNA酶(1 U·μL-1)。程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性20 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30次循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，直接连接克隆载体，转入大肠埃希氏菌感受态细胞，随机挑选多个阳性克隆送华大基因进行测序，测序结果与NCBI比对。

1.3 基因序列分析

测序结果的核苷酸序列用DNAMAN等软件进行分析，利用在线软件 ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质分子量、等电点、不稳定系数等分析；利用ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)进行亲疏水性分析；采用SMART在线工具(http：//smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)进行蛋白保守域分析，勾选PFAM domains选项；利用Cello(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)进行亚细胞定位预测；采用DeepTMHMM(https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM)进行跨膜结构预测。将获得的序列结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，利用DNAMAN对相似蛋白序列进行同源比对。利用MEGA6.06软件以NJ法构建系统进化树，自举检测(Bootstrap)次数设为 1 000，并生成报告图形。

1.4 基因的表达分析

根据测序得到的基因序列，设计上下游引物5′-AGCATCTCCACAACGGAAAC-3′、5′-TTCTTGGA GCAATGACAACG-3′用于表达分析，以肌动蛋白基因5′-GACAACTTACAACTCCATCAT-3′和5′-CTCAT ACGGTCAGCGATA-3′为内参基因[19]。ABi7500实时荧光定量PCR仪用于PCR反应，反应体系包括：2×Master Mix 10 μL，模板 2.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各 0.4 μL，cDNA 1 μL，用水补充体积至 20 μL。反应参数：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃，1 min(40 循环)；基因相对表达量采用2-△△CT法[20]计算。

2 结果与分析

2.1 BoiWRKY15基因的克隆

分别以青花菜基因组DNA和反转录所得cDNA为模板，利用PCR对青花菜BoiWRKY15基因全长进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，获得片段的长度均为1 000 bp左右(图1)。经克隆后进行测序，测序结果在NCBI上进行比对，显示BoiWRKY15编码区序列与野甘蓝(Brassicaoleraceavar.oleracea)WRKY15(XM_013778166.1)和青花菜BOLC4T26829H完全一致。编码区全长为996 bp，编码331个氨基酸。基因的DNA全长1 058 bp，具有2个长度均为31 bp的内含子，内含子符合GT-AG规则。

2.2 序列特征分析

对推导的蛋白质序列进行结构功能域分析发现，BoiWRKY15具有1个Plant_Zn_Clust和1个WRKY结构域，分别位于氨基酸的205～251和253～313处；WRKY结构域中的锌指结构为C2H2型，可用通式C-X5-C-X23-H-X-H(X为任意氨基酸)表示(图2)。

ProtParam在线分析BoiWRKY15的氨基酸序列得知，分子式为C1544H2479N469O488S13，预测蛋白质分子量3 5 837.30 ku，理论等电点为9.75，不稳定系数为58.32，系不稳定蛋白。该基因编码的多肽中苏氨酸(Ser)含量最高，占总氨基酸的16.3%，其次为丙氨酸(Ala)，约为9.7%。其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.517，亲水性氨基酸比例较高，与ProtScale分析结果具有一致性，可知该蛋白为亲水性蛋白(图3)。

图3 BoiWRKY15的亲疏水性预测

Cello分析结果表明，BoiWRKY15定位于细胞核；跨膜结构域预测表明，BoiWRKY15不具有跨膜结构域。这与其作为转录因子发挥作用一致。

2.3 氨基酸序列多重比对及聚类分析

在GenBank中，青花菜BoiWRKY15的氨基酸序列与众多十字花科植物的WRKY15蛋白序列具有较高的相似度，如野甘蓝(Brassicaoleraceavar.oleracea)XP_013633620.1、甘蓝型油菜(Brassicanapus)XP_013686177.2、芜菁(Brassicarapa)NP_001288916.1、萝卜(Raphanussativus)XP_018477660.1、山嵛菜(Eutremasalsugineum)XP_006404816.1、玉山筷子芥(Arabidopsislyratasubsp.lyrata)XP_002878677.1、亚麻荠(Camelinasativa)XP_010429281.1、XP_010417085.1、拟南芥(Arabidopsisthaliana)NP_179913.1和荠(Capsellarubella)XP_006294625.1。将青花菜BoiWRKY15与这些已知WRKY15蛋白进行多重比对，结果表明，不同物种间的WRKY结构域具有高度相似性，它们的核心序列均为WRKYGQK，11个WRKY结构域序列仅玉山筷子芥和萝卜有两处氨基酸差异(图4)。

利用 MEGA 软件计算遗传距离，结果表明，这11条氨基酸序列的遗传距离为 0～0.145，青花菜与野甘蓝之间的遗传距离最低，青花菜和荠的遗传距离最高(表1)。图5展示的家族系统进化关系分析表明，青花菜与野甘蓝的进化关系最近，二者与甘蓝型油菜、萝卜、芜菁可以归为一组，拟南芥和玉山筷子芥归为一组，亚麻荠和荠为一组，山萮菜自成一组。

表1 青花菜BoiWRKY15及其同源序列的遗传距离

图5 青花菜BoiWRKY15及同源序列系统进化关系分析

2.4 表达分析

为明确青花菜BoiWRKY15的组织表达，通过qRT-PCR检测青花菜BoiWRKY15在幼苗根、冠，花期花蕾、花和幼嫩角果中的表达情况，结果发现，青花菜BoiWRKY15在苗期根冠中都有表达，根部表达略高于冠部，而在生殖器官中的表达都高于苗期营养器官，在开放的花和幼嫩角果中的表达量远高于苗期根冠中的表达(图6中A)。

A—组织表达；B—野油菜黄单胞菌侵染下表达。图6 青花菜BoiWRKY15基因的表达情况

而BoiWRKY15在野油菜黄单胞菌侵染下的表达模式检测结果表明，BoiWRKY15受野油菜黄单胞菌诱导，基因表达水平持续升高(图6中B)。0～3 d增长缓慢，而5～7 d表达量显著上升。

3 讨论

WRKY是植物特有的一类转录因子，其 DNA 结合结构域包含约60个氨基酸，氨基端包含高度保守的WRKYGQK(色-精-赖-酪-甘-谷氨酰胺-赖氨酸)基序，并因此得名[21]，羧基端含有一个类锌指结构的基序(CX4-7CX22-23HXH/C)[22]。依据WRKY结构域和锌指结构特点，WRKY转录因子分为3组，Group Ⅰ包含两个WRKY结构域，Group Ⅱ和Ⅲ仅有一个WRKY结构域，Group Ⅰ和Ⅱ转录因子中的锌指结构类型为C2H2，而Group Ⅲ为C2HC[23]。本研究中，克隆得到的青花菜BoiWRKY15，它的序列与野甘蓝WRKY15最为接近，编码蛋白序列具有1个典型的WRKY结构域，特征序列为 WRKYGQK，锌指结构为C2H2型，属于Group Ⅱ。

随着生物技术的发展成熟，大量WRKY家族成员逐渐被鉴定、分离和表达。已有大量研究发现WRKY转录因子响应多种生物和非生物的响应，参与调控植物生长发育过程。在青花菜BoiWRKY15的同源基因中，已报道拟南芥AtWRKY15受活性氧诱导以调节植物生长和盐/渗透胁迫反应，在AtWRKY15过表达植株中，受刺激的内质网与细胞核通讯被联系起来，从而在盐胁迫条件下破坏线粒体应激反应[24]。在油菜中，BnWRKY15过表达可能通过下调受菌核菌诱导的BnWRKY33的表达而增加了甘蓝型油菜对菌核病的易感性[25]。本研究中，青花菜BoiWRKY15基因的表达受野油菜黄单胞菌的诱导升高，暗示该基因可能与黑腐病抗性相关，同时，该基因在花中的高表达暗示其参与生长发育过程，具体作用需要进一步构建转基因植物株系来进行功能验证。

本研究克隆了青花菜BoiWRKY15基因，并对其结构特征、系统进化、亚细胞定位预测及表达模式进行了分析，该基因表达受野油菜黄单胞菌的诱导，推测其参与抗性响应。为后续研究青花菜BoiWRKY15的功能和作用机制奠定了基础。