血管结构异常的先天性心脏病患儿中Vav2基因突变的筛查和功能分析

陈颖慧 冯奕源 冯炜琦 吴逸卓 鲁亚南 于昱

(1.上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所,上海 200092;2.上海交通大学医学院附属新华医院核医学科,上海 200092;3.上海交通大学医学院附属新华医院儿心脏中心,上海 200092)

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是人类最常见的出生缺陷[1],每1 000例新生儿中出现8～12例[2-3],其中约30%属于危重CHD,需在婴儿期干预,否则易导致急性死亡[4]。CHD包括胎儿发育过程中发生的心脏和大血管结构异常[5],其中新生儿血管解剖结构较为复杂,诊断难度高,易发生误诊或漏诊。血管结构异常的CHD常导致无法供给全身足够的氧合血液,临床表现为症状迅速进展的致命发绀型,常伴呼吸衰竭和心力衰竭,需早期手术治疗,部分疾病如不接受适当的干预,患者在出生后第一年的死亡率接近80%[6],例如完全性肺静脉异位连接(total anomalous pulmonary venous connection,TAPVC)、法洛四联症中的主动脉骑跨、大动脉转位(transposition of great arteries,TGA)以及窗型动脉导管未闭(patent ductus arteriosus,PDA)。CHD中大血管结构异常的胚胎学发生机制一直是不断探索的主题,但由于大多数CHD呈散发性,死亡率极高,以往的研究主要是基于散发病例进行生物信息学分析筛选致病候选基因,例如,Bleyl等[7]通过遗传连锁分析发现人类染色体4q12上的位点参与TAPVC,主要包括血管内皮生长因子受体2和血小板衍生生长因子受体2的位点;通过对3个独立CHD患病家庭的全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)鉴定出FLT4的新发突变c.244C>T:p.R82X参与法洛四联症中血管缺陷[8]。但是,CHD往往由多基因导致,病因复杂,小样本测序数据只能解释个体CHD发病的部分机制。大样本测序的全面基因组数据能为CHD的预防、诊断和机制探索提供重要的数据支持,但由于某些大血管结构异常发病率低和早期致死率高,样本收集困难,血管结构异常CHD相关高通量测序的研究报道非常少。

在之前的研究[9]中,本课题组收集了78例散发TAPVC以及100例健康儿童外周血行WES,报道了TAPVC高度相关的致病基因Vav2;同时,在39例PDA患者和100例健康人外周血WES数据中,筛选出Vav2可能与PDA发病高度相关[10],上述基于基因拷贝数变异的分析结果提示Vav2可能是血管发育的关键调控因子。Vav2是Vav家族的第二个成员,是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子,通过结合鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)激活Rho GTP酶家族。在一些物种中,Vav家族成员的蛋白表达随着系统发育而变化[11-13],提示Vav家族可能参与胚胎发育,其中Vav2常表达于高度血管化的器官,例如心脏和胎盘。研究[14]报道,Vav2和Vav3在内皮细胞中共同作用,调节肝配蛋白A1诱导的体内和体外血管生成;此外,Vav2被广泛报道为肿瘤中的促血管生成因子[15-16],与血管生成高度相关。脉管系统早期发育依赖三个过程:血管发生、血管生成以及动脉生成,血管内皮细胞的迁移和增殖在这些过程中起着重要作用。既往研究[17]报道,内皮细胞形成的咽中部内皮链,是肺总静脉的前体,其排列错位会导致TAPVC;此外,多能干细胞诱导的内皮细胞被报道可作为研究TGA的重要细胞模型[18],这些研究提示内皮细胞在此类大血管结构异常疾病发生机制中的重要作用。此前研究[19]报道,Vav2可作为血管内皮生长因子的下游,选择性激活Rac1介导内皮细胞迁移和屏障功能;糖尿病条件下,Vav2激活Rac1促进NADPH氧化酶2的全酶组装加速毛细血管细胞凋亡[20],Vav2在不同条件下的不同作用,提示Vav2在内皮细胞中的重要功能。

尽管目前尚无关于Vav2影响心血管发育的详细分子机制报道,但关于Vav2调控内皮细胞功能参与血管新生的研究以及本课题组的测序数据,均提示Vav2在心血管发育中可能存在重要作用。为进一步研究Vav2与血管发育的详细关系,本课题组汇总血管发育异常疾病的WES数据,从遗传变异角度出发,通过gene-based负荷分析和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)-based关联分析等生物信息学处理,在血管结构异常的PDA患者中筛选得到候选基因Vav2的高度致病突变c.701C>T:p.P234L。本研究主要根据WES获得的生物信息,进一步研究Vav2新发突变在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中的功能,并探讨其对可能调控的下游靶基因的影响,为血管结构异常类CHD发病遗传分子机制提供理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

在上海交通大学医学院附属新华医院收集确诊的血管结构发育异常患儿血液标本117例,同时收集200例与病例组年龄和性别相匹配的健康儿童血液作为对照。该研究按照《赫尔辛基宣言》进行,已获得上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会的批准,样本采集均获得了受试者父母或监护人的书面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

使用Genome Analysis Toolkit鉴定WES数据中Vav2非同义突变(NC_000009.12,NM_001134398),通过参考人群基因组常见数据库gnomAD和ExAC,筛选最小等位基因频率<0.01的罕见突变,通过Mutation Taster、SIFT、LRT以及PROVEAN等数据库评估筛选出致病可能性高的Vav2突变位点。Sanger测序法验证入选病例及对照样本DNA序列。

1.2.2 质粒构建

Vav2过表达质粒和阴性对照购于吉凯基因生物公司;以野生型质粒为模板,设计突变引物,用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)酶对模板进行定点突变,得到突变质粒P234L,突变质粒经过Sanger测序确认。

1.2.3 细胞培养与转染

HUVEC购于美国模式培养物研究所,使用含有10%胎牛血清(Biological Industries)和1%青霉素-链霉素混合液(Yeasen)的高糖培养基(BasalMedia)在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。HUVEC接种于6孔板,待细胞融合度为70%时,使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific)转染空载、Vav2野生型质粒、Vav2突变质粒(P234L)用于后续试验。

1.2.4 qRT-PCR

质粒转染48 h后,根据说明书使用TRIzol提取RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Takara)将1 000 ng RNA逆转录为互补DNA链,通过TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Takara)10 μL体系进行qRT-PCR扩增。以β-actin作为内参,2^-△△CT法对mRNA表达量进行相对定量。引物由上海生工生物技术有限公司合成,序列见表1。

1.2.5 Western blot

质粒转染48 h后,用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液收集HUVEC蛋白,浓度测定后,高温变性蛋白。取20 μg蛋白样本进行SDS-PAGE电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore),经过5%牛血清白蛋白(Aladdin)室温封闭2 h,在4 ℃下与一抗anti-Vav2(Santa Cruz Biotechnology)、anti-GAPDH(Santa Cruz Biotechnology)、anti-Rac1(Proteintech)或anti-Flag(Sigma)4 ℃孵育过夜。第2天用过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(Yeasen)室温孵育2 h后,经过化学发光试剂盒(雅酶)显影蛋白。

1.2.6 细胞增殖检测

质粒转染48 h后,按照3 000个/孔将HUVEC接种于96孔板,于培养后的24、48和96 h去除培养基,加入100 μL 10%CCK-8溶液(碧云天),在37 ℃,5%CO2孵育2 h后测定OD450评价细胞活力。

1.2.7 划痕试验

质粒转染48 h后,待HUVEC密度接近100%,用200 μL无菌枪头垂直于孔板制造细胞划痕,磷酸盐缓冲液清洗后,加入培养基,镜下观察并拍照记录(0 h),放回培养箱继续培养,于8 h和24 h后分别镜下观察并拍照记录,以划痕愈合率(%)评价迁移能力。

1.2.8 成管实验

预冷96孔板,每孔加入60 μL的基质胶(Corning)凝固后,每孔加入100 μL细胞悬液,细胞总数为2×104个,4 h后镜下拍照记录,以成管交点和形成小管直径评价成管能力。

1.3 统计学方法

所有数值均以平均值±平均值的标准误差表示,每组实验至少独立地重复三次。使用GraphPad Prism 8.0进行统计学检验,组间单一协变量间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sanger测序结果和突变保守性分析

Sanger测序结果显示入选病例的第8外显子区c.C701T导致第234位氨基酸从脯氨酸变成亮氨酸,该杂合突变位点在正常对照组中未发现(图1A),且入选病例父母否认家族性CHD病史。跨物种蛋白序列比对显示,该突变位点在脊椎动物中高度保守(图1B),提示该突变可能导致Vav2的功能改变。Mutation Taster网站预测该突变位点具有高度致病性;SIFT评分为0.037,数值越小,提示引起蛋白质功能改变的可能性越大;其中,PROVEAN评分为-4.42,进一步提示该突变可能影响Vav2蛋白功能,该突变具体信息详见表2。

注:图A为对照组和病例组的Vav2测序峰图,黑色箭头指示突变位点;图B为P234L突变在不同物种中的蛋白序列保守性分析;*表示该氨基酸在不同物种间高度保守。

表2 P234L突变的具体信息

2.2 P234L突变对Vav2 mRNA和蛋白表达的影响

质粒转染HUVEC后,野生型Vav2、突变P234L转染组间Vav2 mRNA表达量无明显差异(图2A)。但与野生型相比,该突变的蛋白表达量降低(图2B、图2C),表明这个错义突变影响Vav2蛋白表达。

注:图A为HUVEC质粒转染后Vav2的mRNA表达,ACTB作为内参;图B为HUVEC质粒转染后标签蛋白表达,GAPDH作为内参;图C为HUVEC质粒转染后Vav2蛋白表达。*表示和空载组相比,P<0.05;**表示和空载组相比,P<0.01;#表示和野生型Vav2组相比,P<0.05;##表示和野生型Vav2组相比,P<0.01;ns表示无显著性差异。n=4。

2.3 野生型Vav2和P234L突变对HUVEC增殖能力的影响

通过CCK-8检测野生型Vav2及突变P234L对HUVEC增殖能力的影响,与空载组相比,野生型Vav2转染组HUVEC在24、48和72 h增殖率明显升高(P<0.01);突变P234L转染组在24、48及72 h不影响HUVEC增殖(图3)。

注:**表示和空载组相比,P<0.01;#表示和野生型Vav2组相比,P<0.05;##表示和野生型Vav2组相比,P<0.01;ns表示无显著性差异。n=3。

2.4 野生型Vav2和P234L突变对HUVEC迁移和成管能力的影响

质粒转染HUVEC后,划痕试验结果提示,野生型Vav2转染后能促进HUVEC在24 h内的划痕愈合(上调约40%,P<0.05),而P234L突变转染组不影响HUVEC迁移能力(图4A)。一致的是,与空载组相比,野生型Vav2转染HUVEC 48 h后,可促进HUVEC成管能力(上调约30%,P<0.05);与野生型Vav2转染组相比,P234L突变转染HUVEC减弱了Vav2诱导的HUVEC成管能力(图4B)。

注:图A为HUVEC划痕试验0、8和24 h代表性图片;图B为HUVEC成管实验4 h代表性图片。*表示和空载组相比,P<0.05;#表示和野生型Vav2组相比,P<0.05;ns表示无显著性差异。刻度尺=200 μm;n=3。

2.5 Vav2过表达对下游Rac1 mRNA和蛋白表达的影响

qRT-PCR和Western blot结果提示野生型Vav2、突变P234L转染HUVEC后并不影响Rac1本底表达(图5A、图5B),与文献报道一致,提示Vav2可能调控下游Rac1结合GTP激活而非本底表达。通过对Vav2蛋白结构进一步分析,P234L突变位于Vav2催化DH结构域,这决定了Vav2催化下游Rho GTP酶家族激活(图5C),提示P234L突变可能是通过影响Vav2催化下游Rac1激活进而影响Vav2在HUVEC发挥功能,需进一步检测Rac1-GTP活性形式揭示该突变对下游的影响。

3 讨论

CHD作为一类严重的先天畸形,妊娠期会导致流产、死产和新生儿死亡等,对于存活患儿,身高、体重及智力发育会滞后于同龄健康儿童,是影响儿童身心健康的重大公共卫生事件。大血管结构异常的CHD进展快速、临床症状严重,例如,TAPVC和TGA缺乏足够的氧合血液的供应,患儿出生后如不给予及时治疗将无法存活。但新生儿血管解剖结构复杂,不易辨认,误诊或漏诊率高,延误治疗时机。由于此类疾病低发病率和高致死率,样本收集困难,动物模型少,目前关于大血管结构异常CHD发生的分子机制仍不清楚。CHD是由环境和遗传因素共同作用,具有不完全外显率和可变的表达特性,遗传学相关研究能帮助探究此类CHD发病的分子机制且有助于临床对此类疾病的产前诊断和早期发现。前期研究中117例血管结构发育异常患者的WES结果提示Vav2与此类血管结构异常的CHD高度相关[9-10]。在本研究中,通过生物信息学手段处理前述WES的数据,筛选出Vav2未曾被报道的新发罕见突变c.701C>T:p.P234L,拟从遗传变异角度进一步厘清Vav2在血管发育中的重要功能。Mutation Taster在线预测提示这个突变位点为高度“致病性”位点,且该位点在人类、猕猴、褐家鼠等脊椎动物上高度保守,提示这个突变可能引起重要的功能改变。qRT-PCR和Western blot实验结果表明,P234L突变不影响Vav2 mRNA表达,但蛋白的表达量较野生型有下调,转录和翻译的差异提示这个位点引起的单个氨基酸改变可能会影响Vav2蛋白结构的稳定性。

在哺乳动物胚胎发育过程中,内皮细胞在构建组织化的血管网络中起着至关重要的作用。因此,笔者在HUVEC中进一步探究Vav2罕见新发突变P234L的功能。实验结果提示,Vav2能促进HUVEC增殖、迁移以及成管,具有促进血管生成的作用;而P234L突变能改变Vav2在内皮细胞中促进HUVEC增殖、迁移和成管的积极功能,笔者的研究结果提示Vav2可能是胚胎发育过程中参与血管发育的重要分子,该突变可能是血管结构异常的CHD发病的分子机制之一。

Vav2作为一类鸟嘌呤核苷酸交换因子,通过结合GTP激活Rho GTP酶家族(主要包括Rac1、Cdc42和RhoA),这些成员在GTP结合的活性形式下能参与调节细胞内重要生物学功能,包括细胞生长和蛋白激酶激活等[21]。Rac1作为Vav2广泛报道的下游,Vav2往往与Rac1相互作用后,通过促进Rac1结合GTP形成Rac1-GTP活性形式发挥功能,进而调控内皮细胞、肿瘤细胞的迁移[22]。但是,Vav2是否通过激活Rac1影响内皮细胞功能进而调节CHD发生尚不清楚。qRT-PCR以及Western blot实验结果提示,野生型Vav2以及突变P234L过表达均不会影响Rac1的本底表达,结合之前的研究结果,Vav2更可能是通过催化GTP与Rac1结合发挥作用。通过对Vav2蛋白结构进一步分析,P234L突变位于Vav2催化下游Rho GTP酶家族与GTP结合的DH结构域,P234L突变极有可能是通过影响Vav2催化下游Rac1激活进而影响Vav2在HUVEC发挥功能,需进一步检测下游Rac1-GTP活性形式来研究该突变对下游的影响。

综上所述,本研究发现Vav2错义突变c.701C>T:p.P234L能改变Vav2蛋白序列,影响Vav2蛋白表达,改变Vav2促进HUVEC增殖、迁移和成管的能力,此突变可能是通过改变Vav2蛋白结构进而影响下游Rac1激活而非本底表达导致Vav2的功能改变。Vav2在HUVEC中的功能提示Vav2对血管发育可能至关重要,P234L突变对Vav2功能的影响可能会导致心血管发育的异常,进而导致血管结构异常的CHD发生,但其具体机制有待进一步研究。本研究为血管结构异常的CHD发生机制以及临床早期诊断提供进一步理论依据。