孟德尔随机化探讨三甲胺N-氧化物及其前体与静脉血栓栓塞的因果关系

李梦依 刘英杰 齐灵垚 秦地茂

(西南交通大学附属医院 成都市第三人民医院心电血压研究室 成都市心血管病研究所,四川 成都 610031)

静脉血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)包括深静脉血栓(deep vein thrombosis,DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism,PE),是继心肌梗死和卒中之后第三常见的血管疾病[1]。流行病学研究[2-3]表明,随着增龄,全世界VTE发病率为(1～2)‰。几项研究也证实了VTE患者的高死亡率。例如,一项纳入了7万余人的荟萃分析[4]回顾了86项随机对照试验,结果表明,即使经过治疗,VTE仍然可导致9.8%的受试者死亡。尽管存在系统的治疗和管理,VTE患者的预后仍然很差,其10年复发率为30%[5-8]。考虑到VTE预后不佳,其治疗方面一直是当前的研究热点。

VTE的危险因素较多,如静坐、吸烟以及外科手术术后。最近,据报道[9-10],作为肠道微生态系统中最关键的活性成分,三甲胺N-氧化物(trimethylamine N-oxide,TMAO)及其前体与VTE风险密切相关。当肠道菌群的平衡被破坏时,各种致病微生物增殖并产生过量的TMAO,导致血管内皮细胞、血小板和先天免疫细胞中的炎症途径活化,这将升高VTE风险[11-16]。目前,一些研究人员试图通过各种途径解释TMAO及其前体与VTE的关系。然而,这些研究的样本量较为有限,而且,多为回顾性研究,存在反向因果关系以及不能评估的混杂因素[17]。

孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)是探索暴露与结果之间因果关系的一种流行方法。MR分析主要使用基因变异作为暴露的工具变量,以评估暴露对结果的因果影响。此外,MR研究还可以克服观察性研究的典型缺点,如反向因果关系和潜在混杂因素,使结果更令人信赖[18]。

在本研究中,进行了双样本MR分析,以探讨TMAO及其前体与VTE的主要组成部分DVT和PE之间的因果关系。

1 方法

1.1 研究设计

本研究采用了双样本MR方法[19]。双样本MR必须满足3个假设,即:(1)工具变量与TMAO及其前体密切相关;(2)工具变量不能与DVT和PE相关;(3)工具变量不与影响DVT和PE的混杂因素相关。

1.2 数据来源

TMAO及其前体:为了探讨TMAO及其前体(肉碱、胆碱和甜菜碱)是否与DVT和PE的发病风险增加相关,笔者从全基因组关联研究的荟萃分析[20]中获得了与上述肠道代谢产物相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为工具变量(n=2 076)。然而,该全基因组关联研究识别的位点很少达到全基因组显著性水平,因此本研究提取了具有全基因组显著阈值(P<5×10-5)的SNP作为工具变量。

DVT和PE:DVT和PE的汇总数据来自英国生物银行。英国生物银行是一项包括50多万英国公民的队列研究。通过MR Base平台(ukb-b-12040、ukb-b-18366)访问了英国生物库的数据,其中,DVT数据包括92 441例患者以及453 692例对照人群,计有9 851 867个SNP位点;而PE的数据则包含1 846例患者和461 164例对照人群,计有9 851 867个SNP位点[21]。

1.3 遗传工具变量

为了满足第一个MR假设,即SNP与暴露密切相关,在全基因组水平上选择了与TMAO及其前体显著相关的工具变量(P<5×10-5,r2<0.001,遗传距离=10 000 kb)。此外,由于纳入的SNP易受弱工具变量的影响,还计算了F统计量。如果F统计量显著大于10,则表明弱工具变量不太可能影响结果[22]。最后,为了满足第二个MR假设,即遗传变异与任何潜在混杂因素无关,在PhenoScanner数据库中进行了查询,以确定所包含的SNP是否与已知混杂因素(血脂异常和肥胖)相关。如果是,它们则被排除在外。

1.4 MR分析

在本研究中,使用了五种MR分析方法,包括逆方差加权法(inverse-variance weighting,IVW)、MR-Egger、MR多效性残差和异常值检验(Mendelian Randomization Pleiotropy RESidual Sum and Outlier,MR-PRESSO)、最大似然比法和加权中值法[23-27]。首先,使用了IVW来估计TMAO及其前体与DVT和PE的关系。其次,使用MR-PRESSO、MR-Egger、最大似然比法和加权中值法进一步对IVW结果进行敏感性分析,以验证肠道代谢物对DVT和PE的影响。最大似然比法是一种具有低标准误差的传统方法,通过最大似然来测量潜在分布参数[24]。MR-Egger基于InSIDE的假设,对暴露结果进行加权线性回归,但其易受工具变量的影响[25]。加权中值法可以显著提高因果效应的检测能力,并减少Ⅰ型错误[26]。MR-PRESSO类似于IVW,其因果估计与其他工具变量显著不同[27]。如果少于50%的工具变量存在水平多效性,MR-PRESSO可以提供较为准确的分析。最后,为了有效地解释该MR的结果,进一步计算了相应的OR值以及95%CI。

1.5 水平多效性及异质性

本研究使用了不同的方法来评估潜在的影响。CochranQ统计和MR-Egger回归用于解释研究中的异质性和水平多效性[28]。如果P<0.05,则表明纳入的工具变量中没有偏差和异质性。MR-PRESSO也被用作全局、离群值和失真测试的附加多重性控制。最后,“留一法”敏感性分析和漏斗图法用于评估每个工具变量和结果之间的关系。

所有统计分析均采用R4.1.1软件进行。显著性水平设置为0.012 5(0.05除以4个风险因素)。

2 结果

2.1 肠道微生物群和代谢产物的遗传工具变量

在本研究中发现,rs488419(TMAO)、rs17418675(TMAO)、rs2074755(甜菜碱)、rs16840689(甜菜碱)和rs10883712(甜菜碱)基因座与血脂异常和肥胖密切相关,因此删除了这些SNP。最后,纳入了132个与肠道代谢产物相关的连锁不平衡、非独立的SNP(37个与甜菜碱相关,26个与肉碱相关,23个与胆碱相关,46个与TMAO相关)。工具变量解释的DVT和PE的方差范围为37.14%～87.70%。此外,所有工具变量的F统计值显著大于18.77,有效地消除了本研究中弱工具变量的影响。

2.2 MR分析

基于IVW,发现TMAO每增加1个单位,DVT的相对风险增加0.08%(OR=1.000 8,95%CI1.000 4～1.001 2,P=0.001 3);胆碱浓度每增加1个单位,DVT的相对风险提高0.06%(OR=1.000 6,95%CI1.000 1～1.001 2,P=0.042 0),另外,最大似然法也证实了上述关系。然而,笔者观察到TMAO及其前体与PE风险无关(表1)。

表1 TMAO及其前体与VTE的因果关系

2.3 水平多效性和异质性分析

在MR分析中,较多的工具变量通常会带来更准确的结果,并为MR提供更好的效能,但它也会导致水平的多效性和异质性。因此,使用了一系列方法来评估研究中是否存在显著的水平多效性和异质性。MR-Egger截距和CochranQ检验表明,本研究中不存在水平多效性和异质性的易感性(P值均>0.05)。“留一法”敏感性分析表明,纳入的SNP对结果没有显著影响,表明结果具有显著的可靠性,漏斗图显示不对称分布的SNP,这表明因果关联不太可能受到潜在偏差的影响。MR-PRESSO分析的结果表明,纳入的SNP位点没有任何异常值,与IVW的结果保持一致(图1～图4)。

图1 “留一法”提示TMAO与DVT的敏感性分析

图2 漏斗图提示不对称分布SNP(TMAO与DVT)

图3 “留一法”提示胆碱与DVT的敏感性分析

图4 漏斗图提示不对称分布SNP(胆碱与DVT)

3 讨论

本研究首次采用MR法探讨TMAO及其前体对DVT及PE的影响。基因预测的结果表明TMAO和胆碱可能会增加DVT的风险,但可能与PE风险无关。这些发现表明降低TMAO和胆碱水平可能降低DVT的风险。

作为日常食物的主要来源,胆碱可以在肠道中转化为三甲胺,然后通过门静脉的血液循环被人体肠道吸收,最后由肝脏代谢为TMAO,从而参与人体的各种代谢途径[29]。之前的一些研究[30]中发现,在该过程中,TMAO及其前体(胆碱)与血栓性疾病密切相关。例如,在2011年,一项纳入了1 876例受试者的观察性研究[31]表明,TMAO与急性心肌梗死和外周动脉疾病等血栓性疾病密切相关。随后,Zhu等[14]发现TMAO与血栓事件累积负担增加呈剂量依赖性关系,在调整心血管疾病史、传统心血管疾病危险因素、肾功能和药物使用后,这种关系仍然保持一致。同样,在本研究中,DVT的相对风险随着TMAO浓度的增加而增加。然而,TMAO促进血栓形成的机制尚不清楚。一些研究人员推测,这一机制可能是多种因素共同作用的结果。例如,TMAO可以通过改变1,4,5-三磷酸肌醇信号通路来促进血小板高反应性,增强细胞内Ca2+储备的释放,此外,TMAO还可以激活血小板激动剂如腺苷二磷酸、凝血酶和胶原,并间接增强血小板反应性,从而直接或间接促进血栓形成[32]。最近也有报道[33-34]称,TMAO可以通过激活血管中的炎症反应来介导血栓形成,导致血管内皮细胞损伤。

在本研究中,基因预测还表明,DVT的相对风险随着胆碱浓度的增加而增加,这也与先前的研究一致。一项2017年的前瞻性队列研究显示,补充胆碱后血栓形成的风险增加,即使受试者服用抗血小板药和其他相关药物,血栓形成的潜在风险也并不降低。令人遗憾的是,胆碱促进血栓形成的机制目前尚不清楚,一些研究人员推测其可能与血小板活化有关。例如,胆碱可通过Slc44a2受体介导的线粒体转运代谢为腺苷三磷酸和活性氧[32]。腺苷三磷酸为血小板活化提供能量,其代谢产物腺苷二磷酸可作用于血小板嘌呤能受体,进一步驱动血小板活化并促进血栓形成[35]。此外,活性氧作为另一种代谢产物,也可能通过调节血小板对胶原蛋白的亲和力参与血栓形成[32]。

值得注意的是,本研究使用了大型全基因组关联研究的数据,并进行了双样本MR分析,因此可有效地避免观察性研究相关的偏倚,这为确定肠道代谢产物与DVT之间的关系提供了可靠的证据。此外,使用其他方法进一步验证了本研究的结果,这也使得结果更为可靠。然而,本研究也有一些局限性。第一,研究仅限于欧洲血统的人群,目前尚不清楚这些结果是否可以应用于其他人群;第二,不能完全排除可能的饮食基因或基因环境相互作用的影响;第三,由于本研究中OR值接近1,因此更多的研究将有助于探索这一机制。

总之,在本研究中,发现了TMAO和胆碱可能促进DVT。这提示对于有血栓风险的患者,应该注意TMAO的变化,避免高胆碱饮食。此外,二者之间的确切机制尚不清楚,更多的研究将有助于探索这一机制。