尿液中环境内分泌干扰物暴露水平检测方法建立及应用

周 芳,黄 芳,刘 杰,欧阳械华,马 良,陈 佳

(1.诸暨市中医医院 儿科,浙江 绍兴 311800;2.杭州汉库医学检验所有限公司,浙江 杭州 310051)

环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EEDs)是指能够干扰人体内分泌系统的外源性化学物质,能被人体吸收,并且会通过食物链不断富集,导致人的生殖系统、内分泌系统、神经系统、免疫系统等出现多种病变、癌变、畸变,对人体健康危害极大,尤其是婴儿、幼儿、儿童,可能造成不可逆的身体损害,例如性早熟、肥胖、发育迟缓等[1-5],环境内分泌干扰物暴露已成为人们日益关注的重大环境问题,因此建立环境内分泌干扰物质的快速准确检测方法尤为重要。

目前关于人体EEDs暴露水平检测的文献报道较多[6-12],但存在检测物质种类较少、实际样本检测数量少、未实际应用于临床等问题。本文建立方法同时检测尿液中15种EEDs,包括防腐剂、邻苯二甲酸酯类化合物、双酚类化合物、烷基酚类化合物、激素类药物残留,涵盖目前主要暴露EEDs类别中的主要物质,并应用于614例0～12岁人群临床尿液样本的检测,以期为临床诊断及暴露预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 邻苯二甲酸甲酯、邻苯二甲酸丁酯、邻苯二甲酸乙基己基酯、双酚A 、双酚B、辛基酚、壬基苯酚 、己烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、对羟基苯甲酸丁酯、双酚A-d6、邻苯二甲酸甲酯-d4(德国Dr.Ehrenstorfer公司,纯度均大于98%),邻苯二甲酸乙酯(美国AccuStandard公司,纯度99.7%),对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯(法国EXTRASYNTHESE公司,纯度均大于98%),对羟基苯甲酸乙酯-d4、双酚B-d8(加拿大TRC公司,纯度均大于98%),4-辛基酚-d17、α-乙炔雌二醇-d4(加拿大CDN公司,纯度均大于98%)。

1.2 仪器条件及参数 定量检测采用Agilent 1290-AB Sciex 5500 超高效液相色谱串联质谱仪(美国安捷伦公司-美国AB SCIEX公司)。液相色谱条件:Acquity UPLC©BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美国沃特斯公司);流动相为0.1%乙酸/水溶液-0.01%氨水/乙腈溶液,进样量为5 μL,流速为0.4 mL/min,柱温为45 ℃,流动相B,0～2.0 min,5%～60%,2.0～3.0 min,60%～65%,3.0～3.5 min,65%～95%,3.5～5.0 min,95%～100%,5.0～5.1 min,100%～5%,5.1～6.0 min,5%～5%。质谱条件:电喷雾离子源(ESI),负离子检测模式,Curtain Gas(CUR) 20 psi,Collision Gas (CAD) 9;IonSpray Voltage (IS) -4 500 V,Temperature(TEM) 400 ℃;Ion Source Gas 1 (GS1) 45,Ion Source Gas 1 (GS2) 45,MRM检测方式。质谱检测参数如表1所示。

表1 15种环境内分泌干扰物质谱参数Table 1 MS parameters of 15 environmental endocrine disrupting substances

1.3 校准曲线的配制 环境内分泌干扰物标准品用甲醇(含1 mg/mL BHT)配制成1 mg/mL的一级标准储备液,分别取适量标准储备液,配制成100 μg/mL的混合标准储备液,继续稀释成5 μg/mL的混合标准工作液,然后用2 mol/L乙酸铵水溶液逐级稀释成浓度分别为0.1、0.5、2.5、5、25、50、100 ng/mL的校准曲线溶液。

1.4 样本前处理 取500 μL尿液样本于2.0 mL离心管内,加入100 μL 2 mol/L乙酸铵溶液(pH=6.5)、20 μL混合内标工作液、20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶,涡旋混匀,37 ℃水浴振荡振荡90 min;酶解液冷却至室温,加20 μL甲酸,并加入1 mL乙酸乙酯萃取;取950 μL乙酸乙酯层冻干,用100 μL甲醇复溶,离心取上清液进样分析。

2 结果与讨论

2.1 典型分析谱图 15种环境内分泌干扰物标准物质和尿液样本检测谱图见图1。各物质的保留时间(min)分别为:MMP 2.04,MP 2.26,MEP 2.28,EP 2.55,BPA 2.79,MBP 2.80,PP 2.83,MBzP 2.83,EE2 2.97,BPB 2.98,BP 3.12,DES 3.12,MEHP 3.92,4-OP 4.44,4-NP 4.58。

图1 标准品(A)及尿液样本(B)的UPLC-MS/MS检测选择离子流图Figure 1 Selected ion chromatogram of standard solution (A) and urine sample (B) by UPLC-MS/MS Detection

2.2 线性范围、回归方程及检出限和定量限 配制浓度分别为0.1、0.5、2.5、5.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的15种EEDs的校准曲线溶液,按照1.4方法进行前处理后进样分析,采用内标法定量,15种EEDs的线性相关系数均大于0.999。以3倍信噪比对应的含量为检出限,以10倍信噪比对应的含量为定量限,尿液种15种EEDs的线性、方法检出限和定量限如表2所示。

表2 15种EEDs的线性、检出限和定量限实验结果Table 2 The results of linearity, detection limit, and quantification limit for 15 EEDs

2.3 方法精密度和准确性 在尿液样本中分别加入低、中、高3个浓度的15种EEDs混合标准物质,加标浓度分别为 2.5、25、75 ng/mL,每个浓度平行6次实验,连续测试3天,15种EEDs检测含量的日内精密度均小于10%,日间精密度均小于15%,加标回收率均在80%～120%之间,表明分析结果稳定可靠。

2.4 临床样本分析 收集2018年度于本院儿科就诊的614例12岁及以下人群的尿液样本,采用本研究建立的方法进行测试。样本来源病例均表现出相关临床症状就医、可能为EEDs暴露者,其中:男44例,包括0～3岁4例、4～6岁27例、7～9岁13例、10～12岁26例;女570例,包括0～3岁19例、4～6岁155例、7～9岁396例、10～12岁18例。检测样本来源说明出现临床症状就医的女童数量远高于男童,4～9岁为高发期;在男童和女童所有年龄段中,MP、EP、MMP、MEP、MBP、MEHP检出率为75%～100%,PP检出率为53.85%～96.3%,BPA检出率为25%～56%,MBzP检出率为5.88%～87.88%,BPB、DES、EE2、4-OP、4-NP几乎没有检出。

3 讨论

随着人类社会生产力水平不断提高,人们日常生活中接触到工业制品的机会愈来愈多。而众多工业制品中往往含有一些危害人体健康的物质,其中环境内分泌干扰物(EEDs)就是其中重要的一类。近年来,越来越多的研究开始关注这些EEDs的暴露对人体健康所造成的危害。值得关注的是,与国外调查数据相比较发现,我国人体中邻苯二甲酸甲基酯(MMP)和邻苯二甲酸单(2-乙基己)酯(MEHP)的检出率和含量都非常高,毒性较大的MEHP含量高出国外的2～100倍,分析可能与我国大量生产和使用增塑剂有关。国内学者王小逸等[13]在对北京地区家庭中邻苯二甲酸酯类化合物暴露情况的调查发现,与饮用水相关的塑料来自水管和桶装水,分别占到64%和41%;拥有儿童的家庭中,使用塑料餐具和奶瓶的,占总的儿童家庭的44%和41%。EEDs系列分析可了解日常生活中环境内分泌干扰物的暴露量,如个人卫生用品、塑料食品容器与清洁剂等。因此,评估体内EEDs是帮助患者恢复健康的第一步。

质谱检测方法能够在色谱峰不完全分离的情况下基于质荷比进行准确的定性定量,本文建立了尿液中15种EEDs的超高效液相色谱串联质谱检测方法,6 min内即可实现15种常见EEDs的同时检测,分析通量高,适用于大样本筛查,所使用尿液样本仅为500 μL,前处理操作简便且灵敏度高,实现了体内暴露的EEDs代谢物质的精准检测。而且,同时检测尿中EEDs具有不受外源性污染、采样无人体损伤、采样量足、儿童及家长容易接受的特点。尽管尿中环境激素代谢物的浓度存在一些日间或月间变异,但研究表明检测单份随机尿可以代表6个月内环境激素的平均暴露水平。该方法的建立有助于评估儿童体内环境激素的污染水平,指导家长更加科学地抚养儿童。另外,本研究将该方法应用于临床尿液样本的检测,样本来源说明出现临床症状就医的女童数量远高于男童、4～9岁为高发期;检测结果表明MP、EP、PP、MMP、MEP、MBP、MEHP 7种物质检出率很高,均达到90%以上。该检测结果可对有针对性地预防暴露,以及降低发病率提供科学依据。

环境内分泌干扰物在体内呈累积趋势,因此对未出现临床症状人群的筛查尤为重要;做到早发现、早干预,降低不可逆身体损害的发生概率,需要建立快速、简便、高通量的检测方法进行人群筛查。今后,疾病机理的研究、治疗过程的监测及治疗手段的发展是环境内分泌干扰物分析研究的方向。