溃疡性结肠炎与NLRP3/CARD8基因多态性的相关性分析

杨青华,郭茂东

(1.磐安县人民医院 消化内科,浙江 磐安 322399;2.金华市中心医院 消化科,浙江 金华 321000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)指的是一种结肠慢性免疫介导的炎性疾病,表现为反复发作或迁延不愈的肠道黏膜慢性炎症病变,由直肠黏膜受累起始,可倒灌累及近端结肠。其发生原因可能与肠道免疫功能障碍、环境及遗传等因素相关[1]。UC具有终身复发性的特点,患者需长期随诊,目前临床上治疗UC以诱导和维持为主,内镜下缓解作为治疗目标。轻中度UC患者以5-氨基水杨酸为首要诱导缓解治疗的药物,但病变范围局限于直肠[2];中重度UC患者以口服糖皮质激素并早期联合硫唑嘌呤(AZA)诱导缓解为主要手段,可增加无激素临床缓解率和黏膜愈合率,但AZA可能导致患者发生白细胞减少症,存在潜在的严重不良反应,其安全性尚存在争议。

有研究[3]指出,Nod样受体蛋白3(NLRP3)基因rs10754558多态性可能对NLRP3炎性体的功能具有一定的影响,且与冠状动脉病变严重程度、艾滋病、过敏反应、缺血性心脏病发病等相关。炎症小体组分基因胱天蛋白酶募集域蛋白8(CARD8)则是NLRP3炎性体的重要组成蛋白,可介导IL-1β的活化,现已被证实与炎性肠病、痛风、腹主动脉瘤等疾病密切相关[4]。本研究以溃疡性结肠炎患者作为研究对象,探讨UC与NLRP3/CARD8基因多态性的相关性,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象一般资料 纳入2019年6月—2020年6月于磐安县人民医院就诊的96例中国籍溃疡性结肠炎患者作为研究对象(UC组),另选取96例非溃疡性结肠炎患者作为对照组。对照组中,男56例,女40例;年龄20～75岁,平均(46.87±4.83)岁;UC组中,男53例,女43例,年龄21～74岁,平均(47.13±4.65)岁;2组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得磐安县人民医院医学伦理委员会批准同意。

1.2 诊断标准 溃疡性结肠炎诊断缺乏金标准,入组患者参考《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年·北京)》[5]中溃疡性结肠炎的相关诊断建议进行综合分析,包括①临床表现:青壮年期发病,持续或反复发作的腹泻、黏膜脓血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身症状,病程在4周以上;②内镜检查:结肠镜下溃疡性结肠炎病变从直肠开始,呈连续性、弥漫性分布。轻度炎症可见红斑、黏膜充血和血管纹理消失;中度可见血管形态消失,出血黏附在黏膜表面、糜烂,常伴有粗糙呈颗粒状的外观及黏膜脆性增加;重度可见黏膜自发性出血及溃疡;③组织学活检:活动期固有膜内弥漫性、急性/慢性炎性细胞浸润,隐窝结构改变,黏膜糜烂;缓解期黏膜糜烂或溃疡愈合,固有膜内中性粒细胞浸润减少或消失,慢性炎性细胞浸润减少,隐窝结构改变可保留。

对照组非溃疡性结肠炎诊断标准:参照《中药(新药)治疗慢性非特异性溃疡性结肠炎的临床研究指导原则》中相关诊断标准,即伴有以脐周为主的反复慢性腹痛、粪便有时溏薄有时干结或带有黏液;结肠镜检查下可见黏膜水肿充血,黏膜血管纹路紊乱、模糊,甚至消失;病变部位:直肠、左半直肠。

1.3 研究对象选取标准 纳入标准:各组患者情况符合上述相应诊断建议;同意接受AZA治疗,愿意配合后续随访工作;知情同意。排除标准:合并严重心、肾、肝功能不全的患者,确诊为淋巴瘤或癌症的患者,合并活动性肺结核及活动性病毒性肝炎的患者。

1.4 基因位点检测及分型

1.4.1 DNA提取 采集入组患者2 mL空腹外周肘静脉血作为检测标本,根据DNA提取试剂盒说明书进行全基因组DNA提取,稀释至10 ng/μL后保存于-20 ℃环境中备用。试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司。

1.4.2 DNA扩增 根据美国NCBI数据库检索结果,采用引物设计软件Primer 5.0设计引物,CARD8引物序列:正向为5’-AGTTGACACTAGGAACAGCACGGA-3’,反向为5’-CAATAATGGCTCTGCCTCTGTCTCA-3’;NLRP3引物序列:正向为5’-CCTGAGCTGACCGTCGTCTT-3’,反向为5’-ATGAGGTCACCAAGAGGAACATC-3’。严格根据引物说明书要求对引物进行稀释,得到引物工作溶液后将其置于-20 ℃恒温冰箱中保存备用。于PCR反应前提前取出引物置于4 ℃水浴中复温融化。

1.4.3 基因分型 采用探针法荧光定量PCR检测样本两个不同位点的基因型,每个位点分别进行PCR反应,并应用ABI7900HT Fast Real-Time PCR System自带软件对读取的基因分型。

1.5 治疗方法 UC组患者均采用AZA联合泼尼松龙治疗,AZA使用剂量为每天1.5 mg/kg,泼尼松龙使用剂量为每天1 mg/kg,临床症状控制后逐渐减少糖皮质激素用量至停药,治疗时间为6个月。

1.6 观察指标

1.6.1 NLRP3和CARD8不同位点的基因型和等位基因频率分布 记录NLRP3和CARD8不同位点的基因型,统计各基因型的分布频率。

1.6.2 疗效 治疗结束后,评估疗效,分为缓解、有效和无效。缓解:便血等临床症状消失,大便次数减少,糖皮质激素停用或减量,结肠镜检查黏膜正常。有效:便血等临床症状基本消失,大便次数减少,糖皮质激素减量,结肠镜检查黏膜轻度炎症。无效:便血等临床症状未见好转,大便次数增多,糖皮质激素用量不变,结肠镜或病理检查病灶加重或未改变。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0统计分析软件。各基因型的分布频率及疗效用[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NLRP3基因型及分布频率 NLRP3基因位点rs10754558包含CC、CG、GG 3种基因型,2组的各基因型分布频率见表1。与对照组比较,UC组的CC基因型和C等位基因频率降低,CG、GG及G等位基因型频率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组 NLRP3基因型和等位基因的分布频率[n(%)]Table 1 Distribution frequencies of NLRP3 genotypes and alleles in the two groups [n(%)]

2.2 CARD8基因型和等位基因分布频率 CARD8基因rs2443211位点包括AA、AT、TT3种基因型,各基因型分布频率见表2。UC组AA基因型和A等位基因频率较对照组降低,AT、TT及T等位基因频率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组CARD8 rs2443211位点基因型和等位基因频率分布[n(%)]Table 2 Distribution frequencies of CARD8 rs2443211 genotypes and alleles in the two groups [n(%)]

2.3 治疗前后不同基因型患者的溃疡性结肠炎疗效 UC组患者接受AZA治疗后,共有74例患者得到缓解,缓解率为77.08%。观察不同基因型患者的疗效,结果显示:NLPR3 CC基因型患者的缓解率(90.54%)高于CG、GG基因型患者(40.00%、25.00%),CARD8 AA基因型者的缓解率(80.77%)高于AT、TT基因型患者(36.67%、14.29%),差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

AZA作为一种抗代谢型免疫抑制剂,对缓解溃疡性结肠炎和维持治疗效果有一定的作用。但AZA的相关不良反应(如白细胞减少和胃肠道反应等)则可能会诱发感染,进而对患者的生命安全造成威胁,导致患者治疗中断[6-8]。NLRP3、CARD8基因多态性可能与类风湿性关节炎、缺血性心脏病及Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病等多种存在长期炎症反应的疾病相关[7],其机制可能为CARD8 rs204311的小等位基因可形成终止密码,使得表达CARD8蛋白功能缺失,继而使得Pro-IL-1β过量分泌,而NLRP3 rs1-754558的“功能获得性”小等位基因可促使Pro-IL-1β转化为成熟的IL-1β,引发炎症反应。

本研究结果显示:与对照组比较,UC组NLRP3基因位点rs10754558的CC基因型和C等位基因频率降低,CG、GG及G等位基因型频率增加;CARD8基因rs2443211位点的AA基因型和A等位基因频率降低,AT、TT及T等位基因频率升高。说明NLRP3、CARD8基因多态性在溃疡性结肠炎的发病过程中发挥重要功能,可能影响溃疡性结肠炎的易感性。分析原因可能与rs10754558多态性影响NLRP3炎性组分的表达,从而参与调解溃疡性结肠炎患者的免疫及炎症反应。NLRP3基因rs10754558位点CC基因、CARD8基因rs2443211位点AA基因很可能属于溃疡性结肠炎的易患因素[9],后期可进一步研究其在溃疡性结肠炎发病机制中的作用。本研究结果还显示,NLPR3 CC基因型患者的肠壁炎性反应缓解率明显高于CG、GG基因,CARD8 AA基因型肠壁炎性反应缓解率较AT、TT基因型升高。可见,NLPR3 CC基因、CARD8 AA基因可影响患者的肠壁炎性反应缓解率。

综上所述,NLRP3/CARD8基因多态性均对溃疡性结肠炎患者易感性有一定的影响,且有望成为辅助临床预测溃疡性结肠炎患者预后疗效的参考指标。