猪圆环病毒2 型分离鉴定与致病性研究

●谢春贤

（甘肃省嘉峪关市畜牧技术推广站 甘肃 嘉峪关 735100）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为单股负链环状DNA 病毒，是直径为17 nm 的圆形小病毒粒子，呈20 面体对称，没有囊膜，同时该病毒被认为是目前已知能在哺乳动物细胞中自行复制的最小病毒。现已发现了4 个型，即PCV-1、PCV-2、PCV-3 和PCV-4，其中PCV-2的致病性较高，患病后的仔猪表现为多系统衰竭综合征，一般会出现生长发育迟缓，身体逐渐消瘦，呼吸困难，精神萎靡，皮毛杂乱，食欲减退等症状，而且PCV-2 容易与其他病毒共同侵害仔猪，出现混合感染，使病情加重，增加治疗难度[1-4]。猪感染PCV-2 后可引起免疫抑制，使机体免疫力下降，在生猪养殖领域中流行较广，威胁不同、年龄不同品种的猪，其中对断乳仔猪、育成猪和繁殖母猪威胁最为严重，给养殖户造成巨大的经济损失[5-6]。目前，我国基层养猪业的发展规模不断扩大，PCV-2 的发生频率也不断提高，严重威胁到了我国基层养殖产业的健康发展。通过对猪圆环病毒2 型（PCV-2）的分离鉴定与致病性进行研究，可为PCV-2 的诊断和预防提供指导，以便做好PCV-2 的防控工作。

1 材料与方法

1.1 病料来源2023年2 月，采集疑似猪圆环病毒2 型感染的病死猪的淋巴结和脾脏等病料组织5 份。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒的PCR 鉴定根据GenBank 中发布的PCV-2 基因序列设计的PCV-2 型鉴定引物F1：5'-ACCGTTACCGCTGGAGAAGGAA-'3；F2：5'-TGGTTACACGGATATTGTAGTCCTG-3'；引物大小为549 bp。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。将病料组织按照1∶5 的比例加入无菌PBS 进行研磨后， 取组织悬液进行分离上清液（10 000 r/min 离心5 min），过滤除菌，采用病毒DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，以提取基因组DNA 为模板进行PCR 鉴定。

1.2.2 病毒的分离与培养将PK-15 细胞从液氮中取出室温复苏，在无菌条件下在24 孔板中加入DMEM 培养液（含10%胎牛血清），在37℃5%CO2培养箱中进行培养。取PCR 鉴定阳性的病料组织，按照1∶5 的比例加入无菌PBS 进行研磨，在-80℃条件下反复冻融3 次，取组织悬液进行分离上清液（10 000 r/min 离心5 min），过滤除菌（0.22 nm 的滤器）。当PK-15 细胞单层长到85%时，弃DMEM 培养液，用DMEM 培养液洗涤3 次，按照1∶100 比例加入上清液（病毒液），在37℃ 5%CO2培养箱中吸附1 h 后加入DMEM培养液（含10%胎牛血清），在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养24～48 h，盲传10 代后，收取细胞在-80℃条件下保存，提取基因组DNA，用PCV-2 型鉴定引物进行PCR 鉴定。

1.2.3 间接免疫荧光试验检测将PK-15 细胞在无菌条件下接种于24 孔板中，加入DMEM 培养液（含10%胎牛血清），在37℃ 5%CO2培养箱中培养至65%，将PCR 鉴定为PCV-2 阳性的盲传10 代病毒液，按照上述方法接种到24 孔板中吸附1 h，同时设立空白对照孔，DMEM 培养液（含10%胎牛血清）在37℃ 5%CO2培养箱中培养48 h，进行间接免疫荧光试验检测。

1.2.4 病毒的TCID50 的测定将PK-15 细胞在无菌条件下在接种于24 孔板中,加入DMEM 培养液（含10%胎牛血清），在37℃ 5%CO2培养箱中培养至85%，将间接免疫荧光试验为阳性的病毒液在-80℃条件下反复冻融3 次，离心取上清液（1000 r/min，10 min）并进行10 倍梯度稀释，分别接种于PK-15 细胞，每个稀释度接种10 个重复，同时设立对照组，培养48 h 后进行间接免疫荧光检测，采用Karber 法计算HLC1 株的TCID50[8]。

1.2.5 动物人工感染试验将10 头8 日龄、体重相近的三元杂交仔猪分成2 组，每组5 头。每头仔猪通过肌肉注射的方法攻毒盲传10 代病毒液2 mL，剂量为4.12×107TCID50/头，对照组给予等量的PBS。观察每个试验组仔猪的发病情况，采集病死仔猪的病料组织，采用PCR 方法和间接免疫荧光试验进行PCV-2 鉴定[9]。

2 结果与分析

2.1 病毒的PCR 鉴定结果由图1 可知，从采集的病料组织中扩增到约为549 bp 的目的片段，说明采集疑似猪圆环病毒2 型的病死猪的病料组织中含有PCV-2。

图1 淋巴结和肺脏组织PCR 扩增结果

2.2 病毒的分离与培养

由图2可知，从盲传10代的细胞培养物中扩增到约为549 bp 的目的片段。与预期一致，通过测序分析，确定分离毒株为PCV-2，命名为HLC1株。

图2 淋巴结和肺脏组织PCR 扩增结果

2.3 间接免疫荧光试验检测

由图3 可知，感组PCV-2 阳性的盲传10 代病毒液的 PK-15 细胞可观察到特异性绿色荧光，对照组的PK-15 细胞未见特异性荧光。

图3 接免疫荧光试验检测

2.4 病毒的TCID50 的测定结果

采用 Karber 法计算HLC1 株的TCID50，结果显示，HLC1 株的TCID50为4.12×107TCID50/0.1 mL。

2.5 动物人工感染试验结果

攻毒组的仔猪在攻毒后的3～6 d 出现精神沉郁、采食量减少，被毛粗乱、个别身上出现小红点，其中3 头仔猪在攻毒后的5 d 出现死亡，死亡率为60%。对死亡仔猪进行剖检，可见肺脏、脾脏及淋巴结出现不同程度的病理变化。采集死亡仔猪病料组织，采用PCR 方法和间接免疫荧光试验鉴定PCV-2 为阳性，对照组的仔猪未出现明显临床症状，说明分离的HLC1 株对仔猪具有致病性。

3 讨论

猪圆环病毒对养猪业的危害比较大，尤其是我国PCV2 感染率居高不下，给养殖户造成了巨大的经济损失，临床中PCV-2 单独感染一般不会引起猪发生典型的临床症状，尤其PCV 与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒病病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪附红细胞体、猪副猪嗜血杆菌病等病毒发生混合感染后，将导致感染猪出现严重的临床症状[2-5]。PCV-2 的感染能诱导产生免疫抑制并损害免疫系统，造成免疫功能紊乱，给养猪业造成严重的经济损失[10]。因此，在仔猪的日常的养殖工作中，要定期接种PCV-2 疫苗，降低PCV-2 对仔猪群的不利影响，同时加强饲养管理，减少该病的发生与流行概率。

4 结论

试验从疑似猪圆环病毒2 型感染的病死猪的淋巴结和脾脏等病料组织中分离得到了1 株PCV-2 分离毒株，命名为HLC1 株，其TCID50为4.12×107TCID50/0.1 mL，分离的PCV-2 HLC1 株毒株对28 日龄仔猪具有致病性。HLC1 株分离为PCV-2 疫苗的制备奠定了良好基础。