薯蓣丸联合紫杉醇抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231上皮间质转化作用和机制研究

骆小珊,谢 甦,朱曼荆,黄雅珍,朱久龙,冯豆豆,谢 青,蒙雁云,凌湘力

(1.贵州医科大学,贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学附属医院,贵州 贵阳 550004;3.宁波市北仑区人民医院,浙江 宁波 315800;4.南方医科大学附属中西医结合医院,广东 广州 516006)

乳腺癌严重威胁着全球女性健康,2020年超过肺癌成为全球女性第一大癌症[1]。如今乳腺癌的各种治疗手段正在不断进步,但其治疗后仍有较高的复发转移率[2]。其中,三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)恶性程度高、侵袭性强,手术联合放化疗是目前最主要的治疗手段,但治疗后患者复发转移率高,远期生存率远低于其他类型乳腺癌[3-4]。紫杉醇作为TNBC的一线化疗药物广泛应用于临床。有研究表明,持续的紫杉醇化疗可能会导致肿瘤细胞侵袭、转移能力增强,进而增加患者治疗后的复发转移率[5-6]。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是患者在经历化疗过程中肿瘤细胞获得转移能力的重要机制之一[7]。通过EMT,肿瘤细胞可随血液或淋巴系统浸润至其他器官,并处于可逆的“潜伏”状态,此时肿瘤细胞会通过减缓分裂,争取在化疗造成的恶劣环境中生存,待治疗停止后伺机继续“作案”,最终导致肿瘤远处转移灶的形成[8]。如何抑制肿瘤化疗中EMT的发生,降低肿瘤细胞的侵袭转移能力,进而改善患者预后是当前研究的热点之一。

中药联合化疗药物在增效减毒、减少肿瘤复发转移、改善患者预后等方面展现了独特的优势[9-11]。课题组在前期的临床研究中发现薯蓣丸能减轻TNBC患者化疗的不良反应,降低Ki-67阳性表达[12-13];实验室研究发现薯蓣丸联合化疗药环磷酰胺可抑制TNBC荷瘤小鼠肿瘤的生长、提高化疗后荷瘤小鼠的免疫功能[14],降低肿瘤组织中EMT相关蛋白及mRNA的表达[15]。针对TNBC,薯蓣丸联合紫杉醇能否通过抑制肿瘤细胞EMT,降低化疗中肿瘤细胞的侵袭转移能力尚未得到验证。本研究运用血清药理学方法制备薯蓣丸含药血清,并联合紫杉醇共同干预MDA-MB-231细胞,体外模拟肿瘤细胞在经历化疗药物治疗的同时联合薯蓣丸治疗,观察MDA-MB-231细胞EMT相关指标及侵袭迁移能力的变化,并进一步探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和细胞株:本次研究获得贵州医科大学伦理委员会审批通过,动物伦理审查号为1900650。40只健康SD大鼠,雌性,SPF级,体重(200±20)g,由长沙天勤生物科技有限公司提供[合格证号为:SCXK(湘)2019-0014],动物饲养于贵州医科大学附属医院临床研究中心动物室,在标准的环境条件下,22～24 ℃恒温,湿度45%～50%,普通饲料及蒸馏水喂养,12 h昼夜节律。适应性喂养1周后开始实验,实验遵循“3R”原则。人源TNBC细胞系 MDA-MB-231购自上海中乔新舟生物科技有限公司,批号为:ZQ0118。

1.1.2 实验药物:紫杉醇购自美国MedChemExpress公司,货号HY-B0015/CS-1145。薯蓣丸按中药饮片比例将其配制为颗粒剂,由广东一方制药有限公司提供。薯蓣丸颗粒剂组成:薯蓣(山药)、干地黄各2 g,桂枝、豆蔻、芍药、干姜各0.5 g,神曲、柴胡各0.7 g,麦门冬、白术各1.52 g,茯苓、白蔹各0.25 g,川芎1.3 g,当归3.03 g,阿胶6 g,桔梗1.25 g,杏仁0.35 g,人参1 g,防风0.65 g,大枣7.5 g,甘草3 g。

1.1.3 实验主要试剂:高效RIPA裂解液(R0010)、SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒(P1200)等购自北京索莱宝科技有限公司;BD基质胶(356234)购于美国BD股份有限公司;胎牛血清(04-001-ACS)购于以色列BI公司;mTOR(ab32028)、PI3K(ab40776)、Vimentin(ab92547)等抗体均购自英国Abcam公司;N-cadherin(bs-1172R)、MMP2(bs-22503R)等购自北京博奥森生物技术公司;E-cadherin(20874-1-AP)、GAPDH(10494-1-AP)等抗体购于Proteintech Group,Inc公司。

1.1.4 主要仪器:倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司,Axio);正置荧光显微镜(日本尼康,NIKON ECLIPSE CI);多功能酶标仪(美国BioTec公司,ELX50);细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司中国,FormaTM3111);荧光定量PCR仪(美国ABI公司,ViiA7Dx);台式高速离心机(美国贝克曼库尔特公司,Microfuge 20R);化学发光成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司,ChemiScope3000Mini);水平电泳仪(北京六一仪器厂,DY-6C)。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备:随机把SD大鼠分为薯蓣丸组和空白组各20只,参照文献[16],空白组以10 ml/kg的0.9%氯化钠溶液灌胃,每日2次;薯蓣丸组予以配置好的薯蓣丸药液10 ml/kg灌胃 (含薯蓣丸生药量 3.05 g),每日2次(用药量按成人临床用药剂量每公斤体重为标准,人鼠比例换算后10倍),两组均连续灌胃7 d,末次给药1.5 h后麻醉下腹主动脉取血,无菌条件下分离血清,56 ℃水浴灭活30 min,使用0.22 μm无菌微孔过滤器过滤,于-80 ℃保存备用。

1.2.2 MDA-MB-231细胞培养:人TNBC细胞株MDA-MB-231复苏后,用含10% FBS的DMEM培养基培养,将细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养,每1～2天更换培养基。取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.3 细胞分组与给药方法:实验前我们验证了紫杉醇对MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度(IC50)为991.2 nmol/L。本次研究共设置三组:空白组、紫杉醇组、薯蓣丸联合紫杉醇组。药物干预方法:取处于对数生长期MDA-MB-231细胞在无血清培养基中培养2 h后,空白组细胞给予10%空白血清、紫杉醇组细胞给予10%空白血清联合紫杉醇溶液、薯蓣丸联合紫杉醇组细胞给予10%含薯蓣丸含药血清联合紫杉醇溶液处理,各组均加入DMEM高糖培养基补足体系。以下实验分组均按上述分组设置处理。

1.2.4 CCK8实验检测细胞增殖:取对数生长期的MDA-MB-231细胞,接种于96孔板,调整细胞密度为5×103个/孔,每组设置3个复孔,待细胞贴壁后按上述1.2.3分组设置和药液的配比处理细胞24、48、72 h后,吸出原药液培养基,PBS洗,弃PBS,避光下加入CCK8工作液,37 ℃培养箱内避光孵育1～2 h;多功能酶标仪设置温度37 ℃,波长450 nm,测定各组OD值,并计算细胞增殖抑制率。实验重复3次。

1.2.5 Transwell 小室实验检测细胞侵袭和迁移能力:按上述1.2.3分组设置和药液的配比处理MDA-MB-231细胞48 h后,收集细胞重悬,调整细胞密度为3×105个/孔(侵袭实验时预先用matrige胶包被Transwell小室),于上室中加入200 μl细胞悬液,下层加入600 μl含30%FBS的培养基,置于培养箱中孵育48 h。取出小室,PBS轻洗后,用棉签轻轻擦去matrige胶,4%多聚甲醛固定40 min,结晶紫染色30 min,PBS清洗,轻轻擦去上室未迁移的细胞,待其晾干后于100×倒置显微镜下取5个视野拍照,通过Image J计算细胞数量,求其平均值。实验共重复3次。

1.2.6 Western blot法检测EMT和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达水平:按上述1.2.3分组设置和药液的配比处理MDA-MB-231细胞48 h后,提取细胞总蛋白,按BCA蛋白定量法检测蛋白浓度,确定各组上样量,制10%分离胶,配电泳液、转膜液,加上样液,电泳分离,转膜,5%脱脂奶粉或BSA封闭1.5 h,加入一抗,摇床4 ℃过夜。回收一抗,洗膜3次,加入二抗,37 ℃孵育45 min,洗膜3次。取出PVDF膜,吸净余液,放入成像仪中,滴加适量发光液(1∶1混合A液和B液),高敏模式自动曝光。利用Image J软件分析条带灰度值。实验重复3次。

1.2.7 RT-qPCR实验检测EMT相关指标mRNA的表达:按上述1.2.3分组设置及药液比例处理MDA-MB-231细胞48 h后,收集细胞,PBS洗3次,提取总RNA,检测RNA浓度,稀释后,将提取的RNA逆转录成cDNA,-80 ℃保存。以GAPDH为内参基因,E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和MMP2 为目标基因。每组设3个复孔,采用2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1所示。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 各组MDA-MB-231细胞增殖情况比较 与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组细胞增殖受到明显抑制(P<0.01);与紫杉醇组相比,薯蓣丸联合紫杉醇组抑制细胞增殖能力增强,其中除24 h外,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组MDA-MB-231细胞增殖情况比较(%)

2.2 各组MDA-MB-231细胞侵袭能力比较 与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组细胞侵袭能力明显受到抑制(P<0.01);与紫杉醇组相比,薯蓣丸联合紫杉醇组抑制细胞侵袭的能力显著增强(P<0.01),表明薯蓣丸联合紫杉醇具有协同抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力的作用。见图1、表3。

图1 各组MDA-MB-231细胞侵袭能力比较(结晶紫染色,×100)

表3 各组MDA-MB-231细胞侵袭、迁移能力比较(个)

2.3 各组MDA-MB-231细胞迁移能力能力比较 与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组细胞迁移能力明显受到抑制(P<0.01);与紫杉醇组相比,薯蓣丸联合紫杉醇组抑制细胞迁移能力显著增强(P<0.01),表明薯蓣丸联合紫杉醇具有协同抑制MDA-MB-231细胞迁移能力的作用。见图2、表3。

图2 各组对MDA-MB-231细胞迁移能力比较(结晶紫染色,×100)

2.4 各组MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白表达水平比较 与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组细胞中E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05,P<0.01),Vimentin、N-cadherin和MMP2蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),其中紫杉醇组的MMP2蛋白表达未见明显下调。与紫杉醇组比较,薯蓣丸联合紫杉醇组细胞中E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.05),Vimentin、MMP2蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01)。见表4。

表4 各组MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白表达水平比较

2.5 各组MDA-MB-231细胞PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平比较 与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组细胞中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),其中紫杉醇组的p-Akt、p-mTOR蛋白表达未见明显下调。与紫杉醇组相比,薯蓣丸联合紫杉醇组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01)。见表5。

表5 各组MDA-MB-231细胞PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平比较

2.6 各组MDA-MB-231细胞EMT相关mRNA表达比较 与空白组相比,紫杉醇组、薯蓣丸联合紫杉醇组均能上调E-cadherin、下调Vimentin、MMP2 mRNA的表达(P<0.01),薯蓣丸联合紫杉醇组能下调N-cadherin mRNA的表达(P<0.01),而紫杉醇组上调了N-cadherin mRNA的表达;与紫杉醇组相比,薯蓣丸联合紫杉醇组上调E-cadherin mRNA,下调N-cadherin、MMP2 mRNA表达能力增强(P<0.01,P<0.05)。见表6。

表6 各组MDA-MB-231细胞EMT相关mRNA表达比较

3 讨 论

TNBC是乳腺癌中预后最差的类型,约占乳腺癌总发病率的20%,因其缺乏激素受体及Her2的表达,故对内分泌和分子靶向治疗均不敏感[17],在经历系统治疗后仍有很大部分患者复发转移,这是导致患者治疗后死亡最主要的原因之一。紫杉醇是一种具有抗肿瘤活性的天然药物,其可以通过促进微管蛋白聚合、阻滞细胞周期进程和有丝分裂,从而诱导细胞死亡[18],是目前广泛应用于乳腺癌的一线化疗药物。然而,越来越多的研究表明,紫杉醇在杀死癌细胞的同时,也会增加癌细胞对化疗药物的抗性并促进癌细胞转移[5,19];还可通过激活PI3K/Akt信号通路诱导基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的表达促使肿瘤细胞迁移能力提升[20],这些是紫杉醇治疗后患者肿瘤仍旧复发的可能因素。在众多促进肿瘤转移的机制中,EMT是上皮来源的肿瘤细胞获得侵袭转移能力的关键步骤,其发生的重要标志是上皮细胞标志物 E-cadherin缺失,间充质细胞标志物N-cadherin、Vimentin及MMPs分泌表达的增加,使细胞形态发生改变、黏附力降低,进而促使肿瘤细胞发生迁移、侵袭[21]。PI3K/Akt/mTOR传导通路控制着肿瘤细胞的多种生物学行为,如调控肿瘤细胞增殖、凋亡、自噬等[22],在约70%的乳腺癌患者中被过度激活,该通路过度激活后促使EMT发生是TNBC细胞发生侵袭转移的重要机制[23-24]。

乳腺癌在中医学里属“乳岩”“乳石痈”等范畴,总病机主要概括为“瘀”“毒”“虚”三个方面,其中“虚”贯穿整个疾病的始终,也是乳腺癌复发、转移的决定因素。乳腺癌患者在化疗过程中气血阴阳被耗伤,癌毒残留,极易复发或转移。针对TNBC患者在手术及化疗后正气耗伤,无力抗邪,虚不受补的病机,课题组前期在“护场”理论指导下从后天脾胃入手,选用薯蓣丸进行临床及实验室研究获得良效[12-15,25]。薯蓣丸出自张仲景《金匮要略-血痹虚劳病脉证并治第六》,方中以“薯蓣”(山药)为君统领全方,健脾益气,益胃养阴,平补阴阳,同调气血;合以八珍汤补益气血;阿胶、麦门冬养血滋阴;柴胡、桂枝、防风、白蔹祛风散邪疏络;杏仁、桔梗疏利气机。整方着眼于培补后天之本,“执中州而灌四旁”,集补脾益气、养血滋阴、驱邪理气于一方,攻补兼施、寒热并用、阴阳气血共调,可共奏“护场”之功,限制肿瘤的发展。近年来,薯蓣丸多用于改善患者化疗焦虑抑郁、疲乏、厌食、降低慢性肾功能衰竭患者肾衰进程等[26],但鲜见协同化疗药物抑制肿瘤发展的相关报道。

本研究通过体外实验模拟人TNBC细胞经历化疗药物时加入薯蓣丸共同干预,探索其对MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、迁移的影响,探寻中医药联合化疗药物对肿瘤细胞发挥的作用,并从EMT及PI3K/Akt/mTOR信号通路入手,探究其可能的机制。本次研究结果表明,MDA-MB-231细胞在受到紫杉醇及紫杉醇联合薯蓣丸干预后,可显著抑制细胞增殖、侵袭和迁移能力,其中薯蓣丸联合紫杉醇效果更佳,这表明薯蓣丸联合紫杉醇具有协同增效抑制乳腺癌细胞恶性生物学行为的作用;在调控EMT方面,单用紫杉醇并不能显著调节EMT关键蛋白MMP2,甚至增强了N-cadherin mRNA的表达。MMP2是基质金属蛋白酶家族的明胶酶类,能够降解细胞外基质,在肿瘤细胞生长、分化、侵袭、转移、调节肿瘤血管生成及免疫监视中起到关键作用[27];N-cadherin则是间充质细胞典型的分子标记物,被认为是肿瘤侵袭的启动子;此外,在调控PI3K/Akt/mTOR信号通路时,单用紫杉醇不能有效抑制关键位点p-Akt、p-mTOR的表达。而将薯蓣丸联合紫杉醇共同干预后则有效的抑制肿瘤EMT及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关分子的发展。

综上所述,薯蓣丸联合紫杉醇可以抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭,且具有协同紫杉醇增效的作用,其机制可能与下调PI3K/Akt/mTOR通路进而抑制EMT有关。应用于临床中,薯蓣丸联合化疗药物可能降低TNBC患者治疗后复发、转移率,将有益于乳腺癌患者预后,提高生存率。