甜叶菊药材品质与质量提升研究

赵向阳，余秀萍，吴玮，崔灿，孙婷婷，郭明飞

作者单位：1安徽省宿州市食品药品检验检测中心，安徽 宿州 234000；2宿州市市场监督管理局，安徽 宿州 234000

甜叶菊［Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl］又名甜菊叶、甜茶、甜菊草是菊科、甜叶菊属多年生草本植物［1］。原产地是南美洲巴拉圭东北部与巴西接壤的阿曼拜山脉，我国于20 世纪70 年代从日本引入栽培［2］。目前我国北京、河北、陕西、江苏、福建、湖南、云南等27 个地区均有引种［3］。甜叶菊叶中含有多种活性成分，包括糖苷类［4-5］、绿原酸类［6］、多酚类［7］、黄酮类等。其中甜菊糖苷具有低热量、高甜度的特性［8］，作为天然甜味剂被广泛地应用于食品、饮料和医药等行业［9］。现代医学研究表明，甜叶菊具有抗氧化［10］、抗菌、治疗糖尿病、控制血糖、降低血压、抗肿瘤［11］、抗癌、抗腹泻、提高免疫力［12］，促进新陈代谢、保护心脏［13］等药理作用。有研究［13］表明，甜叶菊提取物能够通过改变高脂饮食诱导肠道菌群，从而达到抑制血脂血糖升高的作用。相关研究［14］显示，甜叶菊水提物可对白化大鼠糖尿病的抗糖尿病作用。同时，甜叶菊糖苷对控制肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳有很好的功效，对心脏病有显著疗效［15］，最重要的是它可消除蔗糖的副作用。

目前，由于中草药的质量受限于地理环境以及温度气候等问题，导致目前的中草药质量难以控制。而《中国药典》尚未收载甜叶菊，各地方中药材标准和炮制规范［16-19］中也仅对甜叶菊的性状、显微和薄层鉴别作了定性要求，并未对指标成分做定量测定，缺少对甜叶菊的质量控制依据。2020 年10 月至2021年12月，本研究以2020年版《中国药典》的方法和要求为指导，对收集到的10 批甜叶菊药材的性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定进行系统研究，为全面控制该药材的质量提供了有效依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Leica DM1000 显微镜；瑞士卡玛CAMAG Visualizer 2 薄层成像系统；德国宾德FP240 型精密干燥箱；合肥科晶KSL-1200X-M 高温箱式炉；1260VWD高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；梅特勒AB-135S 电子天平（0.01 mg）；赛多利斯BSA 124S 电子天平（0.1 mg）；湖北鼎泰高DTA-27 超声波清洗器。

1.2 试药甜菊苷对照品（批号111515-201803，鉴别用）及甜叶菊对照药材（批号121238-200603，鉴别用）均来源于中国食品药品检定研究院，甜菊苷对照品（批号MUST-20070310，纯度99.06%）及莱苞迪苷A 对照品（批号RFS-T00602008024，纯度99.67%）均购买于成都曼思特生物科技有限公司。甜叶菊样品10批，其中安徽省中药材标准起草领导小组提供6 批，宿州市埇桥区群富甜叶菊合作社采集2 批，亳州康美药材市场购买2 批。实验中所用试剂乙腈为色谱纯（美国天地有限公司），水为娃哈哈纯净水，其余分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状及鉴别［20］

2.1.1甜叶菊形态表征 本品多破碎或皱缩，草绿色，完整叶片展平后呈倒卵形至宽披针形，长4.5～9.5 cm，宽1.5～3.5 cm；先端钝，基部楔形；中上部边缘有粗锯齿，下部全缘；三出脉，中央主脉明显，两面均有柔毛；具短叶柄，叶片常下延至叶柄基部；叶革质，质脆易碎。气微，味极甜。粉末呈暗绿色或黄绿色。表皮细胞较大，形状不规则。单列式的多细胞线状非腺毛由5～12 个细胞组成，50～150 µm，稍弯曲。导管多为螺纹导管，直径为15～45 µm，也可见网纹导管。见图1。

图1 甜叶菊表征:A为甜叶菊；B、C、D为显微镜200倍下甜叶菊表皮细胞、导管、非腺毛

2.1.2TLC鉴别 取本品粉末0.5 g，精密称定，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，为供试品溶液。另取甜叶菊对照药材0.5 g，同法制得对照药材溶液。再取甜菊苷对照品，加甲醇制成每1 毫升各含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5 µL，对照品溶液10 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7.5∶4∶0.5）为展开剂，于湿度低于70%环境下展开，取出，晾干，喷以50%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图2。

图2 甜叶菊TLC色谱图（温度20 ℃,RH=55%）

2.2 水分、总灰分、浸出物检查按《中国药典》

2020年版四部通则对10批药材样品进行水分、总灰分、浸出物测定。结果10 批药材样品的水分在8.5%～10.6%，总灰分在5.5%～9.0%，酸不溶性灰分在0.5%～1.6%，醇溶性溶出物在44.5%～54.9%。

2.3 含量测定

2.3.1色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：岛津

Shim-pack GIST（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（35∶65）；设置总流速为：0.5 mL/min。进样量：10 µL；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃；结果显示，此色谱条件下，供试品色谱图中杂质峰对主峰无干扰，甜菊苷和莱苞迪苷A 的分离度大于1.5，峰对称因子在0.90～1.10，理论塔板数以甜菊苷计>5 000，对照品溶液重复进样5 次的相对标准偏差不过1.5%。色谱图见图3，4。

图3 混合对照品溶液色谱图

图4 甜叶菊供试品溶液色谱图

2.3.2溶液的制备 混合对照品溶液制备：精密取莱苞迪苷A对照品40.23 mg置20 mL量瓶中，加50%乙醇溶解，超声60 min，制成浓度为2.011 5 g/L 的对照品储备液。精密称取甜菊苷对照品27.92 mg置20mL 量瓶中，制成浓度为1.396 g/L 的对照品储备液。精密量取莱苞迪苷A对照品和甜菊苷对照品储备液适量，加50%乙醇制成每1 mL 含莱苞迪苷A 1.0 mg和甜菊苷0.5 mg的混合溶液，即得混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品粉末0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，加入50%乙醇50 mL，称定重量，加热回流60 min，冷却至室温，称重，用提取溶剂补足缺失重量，摇匀，滤过取滤液，即得供试品溶液。

2.3.3色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：岛津Shim-pack GIST（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（35∶65）；设置总流速为：0.5 mL/min。进样量：10 µL；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃；结果显示，此色谱条件下，供试品色谱图中杂质峰对主峰无干扰，甜菊苷和莱苞迪苷A 的分离度大于1.5，峰对称因子在0.90～1.10，理论塔板数以甜菊苷计>5 000，对照品溶液重复进样5 次的相对标准偏差不过1.5%。色谱图见图3，4。

2.3.4线性关系考察 取“2.3.2”项下莱苞迪苷A和甜菊苷标准品储备液，以50%乙醇为溶剂分别成稀释成莱苞迪苷A 和甜菊苷标准品系列对照品溶液。取系列对照品溶液，分别按“2.3.3”项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，以对照品质量浓度（X，g/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。结果莱苞迪苷A 和甜菊苷分别在0.10～2.01（r=0.999 7）、0.10～1.171（r=0.999 9）g/L 范围内呈良好线性，线性回归方程分别为Y=1 129.9X+14.836和Y=1 311.4X-4.544 7。

2.3.5精密度考察 取“2.3.2”项下混合对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件重复进样5次，分别测得莱苞迪苷A 峰面积为1 146.42、1 145.61、1 145.12、1 153.60、1 147.90、1 147.21，RSD为0.27%（n=6）。甜菊苷峰面积为508.02、507.81、508.20、509.02、507.82、507.88，RSD为0.09%（n=6），RSD小于2%，表明仪器精密度良好。

2.3.6重复性试验 准确称取同一甜叶菊样品6份，按“2.3.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件检测，所得峰面积代入“2.3.5”线性方程分别求算两成分含量，结果显示，6 份甜叶菊样本中莱苞迪苷A 的含量分别为8.17%、8.27%、8.24%、8.30%、8.27%、8.31%，RSD 为0.58%（n=6）。甜菊苷的含量分别为5.30%、5.32%、5.33%、5.36%、5.34%、5.38%，RSD 为0.45%（n=6），RSD 小于2%，表明该方法重复性良好。

2.3.7稳定性考察 取0.5 g 甜叶菊样本，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备的甜叶菊供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件，分别在0、4、8、12、16、20、24 h测定，记录色谱图峰面积。结果，莱苞迪苷A峰面积RSD 为0.69%，甜菊苷峰面积RSD 为0.30%，RSD小于2%，表明在该方法下制备的甜叶菊中莱苞迪苷A和甜菊苷具有较好的稳定性。

2.3.8回收率试验 精密称取甜叶菊T1 样品0.25g，平行6份，按表6分别加入莱苞迪苷A和甜菊苷对照品适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件检测，计算回收率。见表1。结果显示，莱苞迪苷A 的平均回收率为98.5%，RSD为0.30%；甜菊苷的平均回收率为98.1%，RSD 为0.45%，RSD小于2%，表明回收率良好。

表1 甜叶菊回收率试验（n=6）

2.3.9样品含量测定 取收集的10 批样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，取“2.3.2”项下混合对照品溶液和上述供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件测定，按外标法计算求得莱苞迪苷A 和甜菊苷含量，含量结果见表2。

表2 10批甜叶菊样品的含量

3 讨论

3.1 薄层鉴别条件的优化参照《安徽省中药饮片炮制规范》2019年版［19］中甜叶菊薄层色谱鉴别方法，以甜菊苷对照品和甜叶菊对照药材为对照，先后考察了不同厂家和型号薄层板、样品提取方法、点样量、显色剂、展开剂比例等条件，最终选取德国Merck硅胶G 薄层板，以三氯甲烷-甲醇-水（7.5∶4.0∶0.5）为展开剂，显色剂为50%硫酸乙醇溶液，与原方法相比，各成分分离度更加好，且斑点清晰，Rf值适中。

3.2 含量测定条件的优化

3.2.1色谱条件优化 据文献报道［21-23］，目前测定甜菊苷和莱苞迪苷A 的含量，主要有两种填料色谱柱：C18柱和氨基柱。相比于C18分离柱，氨基柱分离效果更好，但重现性和峰形不好，故选择C18柱测定。实验通过对色谱柱温度、流速、进样体积、流动相种类、流动相比例的优化，达到了最佳的分离度和峰形，确定了色谱条件。与文献方法相比，在该条件下，峰形最优、分离度均能稳定达到1.6以上。

3.2.2提取方法的优化 先后考察不同提取溶剂和提取方式对甜叶菊中甜菊苷和莱苞迪苷A含量的影响，分别使用水、甲醇、50%甲醇、乙腈∶水（30∶70）、无水乙醇、50%乙醇作为溶剂，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。结果以水、50%甲醇和50%乙醇作为溶出介质时效果最佳，无水乙醇溶出最低。相比其他溶剂，杂峰少，峰形好，但在实验中发现用水提取难过滤，易生成絮状物，故将水排除。相比甲醇和乙腈，乙醇没有毒性，故选择了50%乙醇作为提取溶剂。以50%乙醇为提取溶剂，分别考察加热回流和超声两种提取方式，结果表明回流比超声提取充分，故本研究最终选定回流为提取方式。

4 结论

本研究分析了甜叶菊的性状和显微鉴别，建立了TLC 鉴别方法及用HPLC 测定甜菊苷和莱苞迪苷A 含量的方法，初步完成了甜叶菊的质量标准研究工作。结果表明，本方法操作简便，准确度高，重复性、稳定性好，为甜叶菊药材质量评价和监督提供了参考依据。

（本文图1，2见插图10-2）