基于网络药理学和分子对接技术分析少腹逐瘀汤治疗盆腔炎的作用机制及功效成分含量测定

陆姗姗,赵玉荣,葛正萍,邹赟杰,杨晓敏,姚俊宏,陈军,3

(1.南京中医药大学翰林学院,江苏 泰州 225300;2.南京中医药大学,江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心,江苏 南京 210023;3.南京中医药大学,江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏 南京 210023)

少腹逐瘀汤(Shaofu Zhuyu Decoction,SZD)是清代王清任治疗血瘀证的代表药方之一,记录于《医林改错》中。方中共十味中药,该方剂以当归、川芎、赤芍为君药,调经养血,滋补血气。辅以臣药五灵脂、蒲黄、元胡和没药,通畅经络,祛癖止痛进而推陈致新。小茴香、干姜、肉桂为佐药,温经散寒除湿,并能引诸药直达少腹,全方组合使用可温经驱寒,活血祛疲,消肿止痛,为调理血气的一大良方[1]。王清任评价此方能“去疾、种子、安胎”,尽善尽美,为真良善方,临床常用于治疗妇科疾病,如原发性痛经、慢性盆腔炎、子宫内膜异位症等[2-5]。

盆腔炎(pelvic inflammatory disease,PID)是由于逆向真菌感染,通过子宫、输卵管而进入盆腔,导致女性上生殖道和其周边组织引起炎症[6],临床表现多为下腹疼痛,伴有发热头痛、寒颤,下腹包块和局部有压迫刺激感。腰酸胀痛,白带多,月经不调,有淤血,或腹泻、大小解失调[7]。近年来各医家发现用SZD治疗PID有较好的疗效,但目前尚不明确其治疗PID的具体作用机制,且其中的功效成分的含量研究较少。因此,本研究借助网络药理学和分子对接技术对SZD治疗PID的作用机制进行初步的探讨,研究功效成分对核心靶点产生作用的信号通路,并对其中的功效成分进行含量测定研究,有望为SZD的质量控制和治疗PID的作用机制提供新思路和新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与资料Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司,DAD检测器);移液枪(Thermo Scientific);TGL-168高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);ME104E万分之一分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];LXJ-B低速大容量多管离心机(上海安亭飞鸽仪器有限公司);KH-500B超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH-ZK1恒温水浴锅(南京科尔仪器设备有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循环真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);EAC-10T(南京易普易达科技发展有限公司)。

中药系统药理数据库和分析库(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、SwissADME(http://www.swissadme.ch/)、有机小分子生物活性数据库(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、UniPort(https://www.uniprot.org/)、OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、BioinfoGP(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)、STRING(https://www.string-db.org/)、Metascape(https://metascape.org/gp/#/main/step1)、微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)、蛋白质结构数据库(RCSB,https://www1.rcsb.org/)、Cytoscape 3.8.3、OpenBable2.4.1、AutoDockTools 1.5.7。

1.2 试剂与材料川芎、延胡索、赤芍、干姜、小茴香、蒲黄(批号分别为210719、210310、200715、180115、180809、191210)均购自南通三越中药饮片有限公司;当归、五灵脂(批号分别为210601、200701)均购自江苏承开中药有限公司;没药、肉桂(批号分别为210330、210709)购自安徽康和中药科技有限公司。没食子酸(批号:K1714020,含量≥98%)购置于阿拉丁试剂(上海)有限公司;阿魏酸(批号:H27J7L16718,含量≥98%)、芍药内酯苷(批号:O31GB166251,含量≥91.4%)、咖啡酸(批号:M27GS143417,含量≥98%)、异鼠李素-3-O-新橙皮苷(批号:Y17N9H75485,含量≥98%)、延胡索乙素(批号:6024-85-7,含量≥98%)、四氢非洲防己碱(批号:483-34-1,含量≥95%)均购置于上海源叶生物科技有限公司;甲醇(色谱级,批号:67-56-1)、乙腈(色谱级,批号:75-05-8)均购自南京晚晴化玻仪器有限公司;其余试剂为分析纯。

1.3 网络药理学分析

1.3.1 SZD目标成分和疾病作用靶点相关数据集的建立通过中药系统药理数据库和分析库(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),以口服生物利用度值(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性值(drug-likeness,DL)≥0.18为条件对SZD中的中药的化学成分进行筛选,同时结合文献的检索[8],获取有效成分。其中,因“五灵脂”并未在TCMSP中有记录,所以查询相关文献[9],BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)中检索其有效成分,并在SwissADME(http://www.swissadme.ch/)中对检索到的有效成分进行筛选,其条件为,Pharmacokinetics中的GI absorption为“High”,Druglikeness中前5项至少有2项为“Yes”[10]。

1.3.2 药物成分和疾病靶点的预测与筛选以各有效成分的英文名为关键词在有机小分子生物活性数据库(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索,选择综合性最高的,下载其3D结构。利用PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)对成分的作用靶点进行预测。根据文献[11],以“Norm Fit>0.8”对在PharmMapper中预测所得的靶点进行筛选。将靶点导入UniPort(https://www.uniprot.org/),限定物种为“Human”,并将靶点名称转换为相应的Gene Id。通过OMIM(https://omim.org/),Gene Cards(https://www.genecards.org/),DrugBank(https://go.drugbank.com/)等数据库挖掘PID靶点,以“PID”为关键词进行检索,将名字并未转换为Gene Id的靶点导入UniPort蛋白数据库(https://www.uniprot.org/),并限定物种为“Human”进行转换。合并在3个数据库收集转换过的靶点,删除重复值,得到PID的靶点。

1.3.3 收集SZD-PID共同靶点并构建蛋白质互作网络将SZD的靶点与PID的靶点导入BioinfoGP(https://bioinfogp.cnb.csic.es/),绘制Veen图获得交集靶点,将交集靶点导入STRING(https://www.string-db.org/),将群体设置为“Homo Sapiens”,可获得交集靶点的初步PPI网络图,设置“minimum required interaction score”为“Highest Confidence”删除游离的靶点,接着将网络图导出为tsv格式,导入Cytoscape 3.8.3对其进行分析,最终得到SZD-PID的关键靶点。将中药、各中药的药物成分和药物成分的关键靶点导入Cytoscape 3.8.3软件中,构建中药-有效成分-靶点网络图。

1.3.4 GO功能和KEGG通路富集分析基因功能注释分析数据库Metascape(https://metascape.org/gp/#/main/step1)集成了诸多权威生物信息数据库。因此,先将交集靶点导入Metascape,设H.Sapiens为生物群体,再分次进行KEGG通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO Molecular Functions;GO Biological Processes ;GO Cellular Components 功能富集分析,即得到信号通路,分子功能,生物过程,细胞组成的相关的富集分析结果。以KEGG通路结果的绘图分析为例,将得到的KEGG通路将log P值转换为P值后,按P值从小到大进行排序,排列出前20的信号通路,利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)对20条通路进行可视化分析,进行富集气泡图的绘制。

1.3.5 分子对接技术验证功效成分与核心靶点结合的能力分子对接是通过结构特征来预测成分与目标蛋白结合能力的一种辅助手段,涉及分子间的空间匹配和能量匹配[12]。选取有效成分排名靠前的几种成分,在PubChem下载药物小分子配体并保存为sdf格式,接着通过OpenBable 2.4.1转换为mol2格式。然后在蛋白质结构数据库RCSB(https://www1.rcsb.org/),按照Resolution大小排序,下载Resolution最小值的大分子蛋白并保存为PDF格式。接着将PDF格式的蛋白导入pymol进行去水去配体的操作,将操作好的文件导入AutoDock Tools 1.5.7进行两次对接,对接结果保存为PDBQT格式,将PDBQT格式的文件另存为PDB格式,将PDB格式的对接结果导入pymol进行分析对接结果可视化分析。

1.4 含量测定方法的建立

1.4.1 色谱条件以Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;以乙腈为流动相A,0.1%甲酸水溶液为流动相B,按如下设置进行梯度洗脱:0～3 min,1% A→5% A;3～5 min,5% A→10% A;5～10 min,10% A→30% A;10～20 min,30% A→33% A;20～22 min,33% A→5% A;柱温35 ℃;流速1.0 mL·min-1;进样量10 μL;检测波长为260 nm(测定阿魏酸时为323 nm)。

1.4.2 对照品溶液的制备精密称取阿魏酸、芍药内酯苷、没食子酸、咖啡酸、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氢非洲防己碱对照品适量,各自加甲醇溶解,定容于10 mL棕色容量瓶中,作为对照品溶液。分别取对照品溶液各1 mL,混匀后过0.45 μm微孔滤膜,即得混合对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备按药典比例(当归-川芎-赤芍-肉桂-小茴香-五灵脂-没药-蒲黄-延胡索-干姜3∶2∶2∶1∶0.2∶2∶2∶3∶1∶0.2)称取各药材共164 g,置圆底烧瓶中,用10倍量水煎煮提取2次,每次40 min,合并煎出液,用旋转蒸发仪减压浓缩至稠膏状,冷冻干燥得SZD冻干粉末[8]。取冻干粉末1 g,加甲醇10 mL,称重,超声(250 W,40 kHz)处理30 min后,再称重,用甲醇补重,经3 000 r·min-1离心10 min,取上清液过0.45 μm微孔滤膜,待进样分析。

1.4.4 含量测定方法的建立及方法学考察

1.4.4.1 线性关系考察精密量取混合对照品溶液,分别稀释一定倍数后,按设定的色谱条件进样检测,以质量浓度为横坐标(X),对照品峰高为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程。

1.4.4.2 精密度试验精密称取样品,进行供试品溶液的制备并连续进样6次,计算供试品溶液中的阿魏酸、芍药内酯苷、没食子酸、咖啡酸、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氢非洲防己碱的峰高RSD。

1.4.4.3 重复性试验精密称取样品6份,进行供试品溶液的制备并进行测定,计算供试品溶液中的7种药物的质量分数RSD。

1.4.4.4 稳定性试验精密称取样品,进行供试品溶液的制备,分别在0、2、4、8、12、24 h进行测定,计算供试品溶液中7种药物的保留时间及峰面积的RSD结果。

1.4.4.5 加样回收率试验取已知含量的同一批供试品,精密称定6份,分别按已知指标成分含量的100%加入7种药物的混合对照品溶液,制备供试品溶液并进行测定,计算以上各成分平均加样回收率。

2 结果与分析

2.1 SZD有效成分的收集及其靶点的预测与筛选通过中药系统药理数据库和分析库,以OB≥30%、DL≥0.18作为条件对SZD的化学成分进行筛选,共检索出160个有效成分。其中,五灵脂在TCMSP中并未有收录,在查询文献和BATMAN-TCM数据库,经过在SwissADME整合后得到58个有效成分。因此,SZD组方中共筛选出218个有效成分。

通过Pharmmapper平台进行预测,以“Norm Fit>0.8”为条件对得到的靶点进行筛选,剔除重复靶点后共获得了199个靶点。通过OMIM、GeneCards、DrugBank挖掘PID的靶点,经合并去重,共整合得到2558个靶点。

2.2 SZD-PID共同靶点的收集将在数据库挖掘的相关治疗PID的靶点与SZD的功效成分的作用靶点在BioinfoGP相互取交集,共筛选出97个交集靶点,绘制Veen图(见图1),即为SZD治疗PID的潜在靶点。

图1 SZD-PID靶点交集图

2.3 靶点的蛋白质互作网络构建将SZD与PID的交集靶点输入STRING数据库,即可获得PPI网络。在Cytoscape中导入蛋白网络的tsv文件进行分析,如图2所示。有颜色的节点表示为靶点,而直线代表各节点间相互作用关系,共包括70个节点,352条线。节点的大小,节点内文字的大小,颜色的深浅都与节点的degree值呈比例关系,degree值越大,颜色越深,节点越大。首先利用degree值的二倍中位值进行第一遍筛选,接着利用CytoNCA插件进行拓扑分析筛选后节点的BC(betweenness centrality)、CC(closeness centrality)、degree的中位值进行第二遍筛选,其中degree的中位值为18,BC为0.053 535,CC为0.589 744,其中以上3 个参数都大于中位值的靶点有14个,以degree值为最终标准,选取蛋白酪氨酸激酶类(SRC)、热休克蛋白类(HSP90AA1)、丝裂原活化蛋白激酶类(MAPK1)3个靶点蛋白作为核心靶点进行进一步的研究,其相关信息见表1。

表1 靶点信息

图2 PPI网络互作图

2.4 GO富集和KEGG通路分析为了进一步了解SZD治疗PID的具体作用机制,在Metascape内导入交集靶点进行KEGG和GO富集分析。获得KEGG通路160条,BP为1 059条,CC为54条,MF为94条。由图3可知,KEGG中排名前几条,涉及基因数较多,排名前几的通路分别为癌症中的通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、FOXO信号通路、内分泌抵抗等。

图3 KEGG通路和BP富集分析图

图4 CC和MF富集分析图

GO功能富集分析是指在某一功能层次上统计所涉及的蛋白或基因数目而组成的有向无环图,包括分子功能,生物过程,细胞组成[13]。经筛选,由GO富集分析结果图3～4可知,SZD治疗PID的作用靶点中排名较为靠前的生物过程主要是对激素的响应、激酶活性的调节、酶联受体蛋白信号通路、激酶活性的正向调节等。涉及的细胞组成为囊腔、分泌颗粒腔、细胞质泡腔、膜筏等。涉及的分子功能为蛋白激酶活性、激酶活性、脂质结合等。

2.5 中药-有效成分-靶点网络图的构建中药复方通常具有多种药理作用,其成分可能作用于多个不同的靶标[14]本研究构建的中药-有效成分-靶点网络图(见图5)包含个325节点,3 420条边,但仅显示114种成分,这是因为另外多种成分在数据库中未有相关靶标的记录。不同颜色和形状的节点分别代表了SZD的中药组成,有效成分和潜在靶点。黄色为SZD中的十味中药,粉色菱形节点为潜在靶点,多色圆形为不同中药的有效成分。对节点网络进行分析以筛选网络中关键的成分,其中,排名前几的成分包括阿魏酸、芍药内酯苷、没食子酸、咖啡酸、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氢非洲防己碱,表明这7种成分可能是SZD治疗PID的关键成分。

图5 “中药-有效成分-潜在治疗靶点”网络

2.6 分子对接实验验证功效成分与核心靶点的结合能力分子对接技术是基于模拟配体与受体作用(包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等),预测蛋白-蛋白或小分子-蛋白间的结合模式及亲和力,从而虚拟筛选药物靶点及预测药效成分。由 PPI 的结果可知基因SRC、MAPK1、HSP90AA1在SZD治疗PID的生物网络中扮演着重要角色,故利用Autodock对上述核心靶点与筛选出的7种成分进行分子对接,从而检验化合物和靶点的结合活性。由统计的对接结合能可知(结果见表2,可视化分析见图6),多项分子对接平均结合能均小于0,表明核心靶点与关键成分之间能够自发地进行有效地结合。其中,异鼠李素-3-O-新橙皮苷与SRC和MAKP1靶点的平均结合能为0.06,不能自发地结合,延胡索乙素和MAKP1之间无氢键的作用,无法给出分子对接的可视化图。因此,SZD可能通过以上关键靶点干预PID的相关通路,从而达到改善或者治疗PID的作用。

表2 SZD的功效成分与靶点的分子对接结合能

2.7 SZD中治疗PID的功效成分的含量测定

2.7.1 方法学考察SZD中7种功效成分的线性关系结果如表3和图7所示,在一定浓度范围,7种成分的线性关系良好。稳定性的结果表明仪器精密度良好、试验方法的重复性和稳定性良好,加样回收率结果表明试验方法的准确率高。

表3 7种成分含量测定的方法学考察结果

2.没食子酸;6.咖啡酸;8.芍药内酯苷;11.阿魏酸;12.异鼠李素-3-O-新橙皮苷;13.四氢非洲防己碱;16.延胡索乙素

2.7.2 样品的测定取3批SZD饮片,制备供试品溶液进行峰面积的测定,计算7种功效成分的含量并计算均值,其中,阿魏酸、芍药内酯苷、没食子酸、咖啡酸、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、延胡索乙素、四氢非洲防己碱7种功效成分的含量分别为(1.273±0.038)、(0.533±0.057)、(0.093±0.012)、(0.122±0.016)、(4.009±0.140)、(1.069±0.130)、(0.296±0.022) mg·g-1。

3 讨论

本文研究发现SZD治疗PID的主要靶点有SRC[15-16],MAPK1[17-19],HSP90AA1[20-21]等,主要涉及的生物过程有激素的反应、激酶活性的调节等,细胞组分为囊腔、分泌颗粒腔、细胞质泡腔等,分子功能有等蛋白激酶活性、以醇类作为受体的磷酸转移酶活性等。主要的信号通路主要参与调节癌症的途径、MAPK信号通路[22-24]、PI3K-Akt信号通路[25-29]等通路发挥调控作用。利用拓扑分析对网络模型进行分析,发现SZD的多成分多靶点的药理作用形成了复杂的网络,筛选出关键的7种功效成分。通过分子对接验证[30-32],发现7种功效成分与核心靶点有较好的结合活性。因而本研究认为,SZD治疗PID的作用机制[33-34],是通过关键功效成分与核心靶点相结合,调控相关的信号通路,抑制炎症因子的活性,降低炎性反应,从而发挥治疗PID的作用[35-36]。并通过HPLC-DAD法进行SZD中7种成分的含量测定研究,揭示出汤中治疗PID的有效成分的含量,为SZD的临床应用提供有力支撑。