基于HPLC-CAD的参麦颗粒中糖含量与色度值的相关性分析及糖摄入量评估

雷蓉,刘亚茹,苏建,刘永利,

(1.河北省药品医疗器械检验研究院,河北省中药质量评价与标准研究重点实验室,河北 石家庄 050227;2.河北医科大学,河北 石家庄 050017)

参麦颗粒收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册,是由红参、南沙参、麦冬、黄精、山药和枸杞子六味药材提取浓缩成清膏加辅料蔗糖920 g制粒而成,具有养阴生津的功效,用于食欲不振、神经衰弱等症状,临床上可以用于治疗心悸气短[1-2]。蔗糖属于双糖,是由一分子果糖和一分子葡萄糖脱水缩合而成,在高温情况下,蔗糖会分解产生果糖和葡萄糖,并形成一种焦糖色素复杂的混合型化合物,造成颜色的变化[3]。色泽作为一种外观特征,在中药材质量评价方面发挥着重要作用,因此本研究通过色泽评价配方颗粒的质量。通过眼睛观察判别颜色的传统手段存在严重不足,易受人为影响,而将颜色进行量化的仪器客观性更强,可以很好地弥补这一缺点[4-6],电喷雾检测器(CAD)适用于检测不挥发或者半挥发性成分,本研究采用高效液相色谱串联电喷雾检测器(HPLC-CAD)测定参麦颗粒中糖类成分[7]。市售的参麦颗粒来源于3个厂家,研究发现不同厂家参麦颗粒颜色差异较大,经调研,3家企业生产工艺中制粒温度稍有差异,因此运用Lab色彩模式对其进行色泽分析,并且将色度值(L*、a*、b*)与糖类成分含量进行结合分析,探究参麦颗粒的颜色与糖类含量的内在关系。现已有多项研究通过色泽来预测中药材中化学成分含量的高低,有研究表明,根据金银花颜色指标预测其所含总黄酮类成分质控含量的方法可行[8],可通过蒸制过程中何首乌颜色变化预测二苯乙烯苷、蒽醌类成分的含量[9]。

参麦颗粒所含辅料蔗糖主要用于改善味道,以矫味剂和填充剂的作用而存在。但糖摄入过多会对身体造成危害,因此有必要控制辅料蔗糖的投入量。目前有关游离糖的控制已广泛渗透到食品行业,世界卫生组织以及《中国食品膳食指南(2022)》中均对食品中的游离糖进行了控制,但药品方面相关的政策法规尚不完善,因此本文章参考食品中游离糖的控制限度,通过计算参麦颗粒中游离糖的含量进而对每日糖摄入量进行评估,为科学指导患者健康提供了新的思路,为参麦颗粒的进一步研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo公司);XPE26 型电子天平(0.001 mg)、XS105DU 型电子天平(0.01 mg)均购于瑞士Mettler-Toledo公司;KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);超纯水系统(Milli-Q,美国Millipore公司)。

1.2 材料果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品(批号依次为100231-202008、110833-202109、111507-202105,质量分数依次为99.9%、99.9%、99.8%,中国食品药品检定研究院);乙腈为色谱纯;水为超纯水。

30批次参麦颗粒样品抽自全国各地经营、使用单位,涉及3个厂家,其中A厂家样品10批次(S1～S10),B厂家样品10批次(S11～S20),C厂家样品10批(S21～S30)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为GRACE Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,水为流动相B,梯度洗脱(0～20 min,75%A;20～25 min,75%～90%A);柱温为30 ℃;流速为1.0 mL·min-1;进样体积为1 μL;CAD检测器参数:雾化温度35 ℃,幂率1.6,采样频率10 Hz。HPLC-CAD色谱图见图1。

1.果糖;2.葡萄糖;3.蔗糖

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液精密称取各对照品适量,加水制成果糖、葡萄糖、蔗糖的浓度分别为0.896、0.221、50.479 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取参麦颗粒样品粉末约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入10 mL水,密塞,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)15 min,放冷,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察取混合对照品溶液1、0.5、0.2、0.1 mL,加水定容至5 mL,得到不同浓度的稀释液,将混合对照溶液及其稀释液进样测定。以对照品溶液的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程,结果见表1。

表1 参麦颗粒中3个糖类成分的线性关系考察结果

2.3.2 精密度试验取混合对照溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次,记录果糖、葡萄糖、蔗糖的峰面积,结果表明,相对峰面积的RSD分别为1.8%、3.5%、3.8%,表明方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取供试品溶液(S30),分别于0、2、4、6、8、12、24 h时进样测定,记录峰面积进行计算,得到果糖、葡萄糖、蔗糖的峰面积的RSD分别为1.7%、2.3%、2.6%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验取参麦颗粒粉末(S30),按“2.2.2”项下方法制备低、中、高3个浓度的样品,每个浓度平行制备3份,按“2.1”项下色谱条件分别进样,记录色谱图。结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD均小于1.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,表明该方法重复性较好。

2.3.5 加样回收率试验取已知成分含量的参麦颗粒粉末0.25 g,共9份,按样品中待测成分含量的50%、100%、150%精密加入各对照品,按“2.1”项下色谱条件分别进样,计算得到果糖、葡萄糖、蔗糖的平均加样回收率分别为100.74%、103.20%、101.94%,RSD分别为1.3%、1.4%、2.8%,表明方法准确度良好。

2.4 含量测定取参麦颗粒样品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,计算样品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量,结果见表2。绘制各厂家蔗糖平均含量箱式图(见图2)。参麦颗粒处方中规定加入辅料蔗糖的量为920 g,则每袋含蔗糖为23 g,3个厂家蔗糖平均含量均超过23 g/袋,提示制法项未考虑出膏率的变化,固定辅料用量不合理。

表2 参麦颗粒中3个糖类成分的含量测定结果(g/袋)

2.5 参麦颗粒色度值的测定不同厂家生产的参麦颗粒颜色差异明显,因此通过测定不同批次样品的色度值准确的分析不同厂家之间的差异性。将参麦颗粒置于同一光源下进行拍照,将照片上传至Adobe Photoshop软件测定色度值L*、a*、b*,平行测定5次,取平均值,通过E=(a*2+b*2+L*2)1/2,计算总色度值E[10],结果见表3。

表3 参麦颗粒色度值测定结果

2.6 参麦颗粒糖含量与色度值的分析

2.6.1 相关性分析利用SPSS 21.0软件对参麦颗粒的色度值(L*、a*、b*)及参麦颗粒中3种糖类(葡萄糖、果糖、蔗糖)的含量进行皮尔逊分析,结果见表4。由表可知,参麦颗粒中果糖和葡萄糖的含量与色度值L*呈极显著负相关,与a*呈极显著正相关,与b*呈显著负相关;表明参麦颗粒的明度越低,颗粒越偏红、偏蓝,对应的果糖和葡萄糖含量越高。3个厂家中,B厂家颗粒的颜色最深,对应的葡萄糖和果糖含量最高,C厂家葡萄糖与果糖含量次之,A厂家最少,有文献表明,在高温情况下,蔗糖会分解产生果糖和葡萄糖,并形成一种焦糖色素复杂的混合型化合物,造成颜色的变化[3],提示B厂家制粒过程可能存在温度过高造成蔗糖分解。

表4 参麦颗粒糖类成分和色泽相关性分析

2.6.2 聚类分析将参麦颗粒的色度值以及3种糖类成分的含量参数导入OriginPro 2021软件进行系统聚类分析(HCA),结果见图3。由图可知,当相对聚类距离为8时,30批样品按厂家分别聚为三类,聚类效果明显,表明3个厂家样品的颜色及所含糖类成分的含量有明显区别。

图3 参麦颗粒糖类成分与色度HCA图

2.6.3 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)以参麦颗粒的色度值(L*、a*、b*)及参麦颗粒中3种糖类(葡萄糖、果糖、蔗糖)的含量为变量,利用SIMCA 14.1软件进行PLS-DA分析,结果如图4,模型参数累积方差贡献率(R2Y)为0.888,预测优度系数(Q2)为0.866,均大于0.5,表明模型构建成功,由图4可知,3个厂家样品分别聚为三类,与聚类分析结果一致,其中S26超出边界范围,可能是由于其所含蔗糖量比C厂家其他批次样品中所含蔗糖量少所致。

图4 参麦颗粒糖类成分与色度PLS-DA图

2.7 参麦颗粒中糖摄入量评估

2.7.1 糖过量摄入对健康的危害糖作为人体的重要能量来源,贯穿于整个生命历程。但国内外有研究表明,糖摄入量过多可能会引起口腔健康问题以及糖尿病、肥胖、高血压、高血脂等一系列代谢性疾病的发生,这些代谢性疾病进而引发心血管疾病[11-12]。牛津大学的Rebecca Kelly等发现从食物中摄取的游离糖越多,相关的心血管疾病风险就越高[13]。James等[14]研究表明控制含糖的碳酸饮料的摄入,可以降低肥胖发生的危险,用助于控制体重,因此控制每日糖的摄入量很有必要[15-16]。

2.7.2 糖摄入相关政策游离糖是指由厂商、厨师或消费者添加到食品和饮料中的单糖(如葡萄糖、果糖)和双糖(如蔗糖或砂糖)以及天然存在于蜂蜜、糖浆、果汁和浓缩果汁中的糖。WHO建议成年人和儿童应将其每天的游离糖摄入量降至其总能量摄入的10%以下,进一步降低到5%以下或者每天大约25 g会更多益处;《中国居民膳食指南(2022)》中也提出,儿童和成人控制添加糖的摄入量,每天不超过50 g,最好控制在25 g以下。由此可见有关糖摄入量的控制越来越得到全球的关注。

2.7.3 糖摄入量及供能比的计算参麦颗粒是由六味药材及辅料蔗糖所制的中成药,参麦颗粒中蔗糖的含量远远超过果糖和葡萄糖的含量,因此选择蔗糖作为评估指标。根据参麦颗粒中蔗糖含量结果,经过简单评估的方法计算参麦颗粒中蔗糖的每日摄入量(公式1)及其供能比(公式2)。个体摄入的总能量采用“2018年中国居民食物消费量调查”13 083名调查对象的个体食物消费量和《中国食物成分表2002》《中国食物成分表2004》中食物能量数据计算得出。将每日摄入量结果导入OriginPro 2021软件绘制分组柱形散点图,结果如图5所示,由图可知,蔗糖的日摄入量占总能量摄入的百分比均超过10%,违反了WHO及《中国居民膳食指南(2022)》中的建议,可能会对人体造成危害,因此提醒生产厂家应减少辅料蔗糖的投入或者制备成无糖制剂供患者服用。

图5 参麦颗粒中蔗糖供能比图

参麦颗粒中蔗糖的每日摄入量公式为:

参麦颗粒蔗糖日摄入量=F×C

(1)

参麦颗粒中蔗糖的供能比公式为:

(2)

式中,TE(%)为个体供能比,F为每日服药频次,C为参麦颗粒中蔗糖含量,TE为个体摄入总能量。

3 讨论

实验考察了供试品溶液的提取溶剂(50%乙醇、70%乙醇、水)、提取时间(10、15、20 min)对果糖、葡萄糖、蔗糖提取效率的影响,通过对比分析发现,用水提取效果更好,并且超声15 min 3种糖类成分均已提取完全,最终确定供试品制备方法为用水超声15 min。

采用聚类分析、OPLS-DA分析多种化学计量学分析方法对来自3个厂家的30批参麦颗粒样品的糖类成分含量与色度值进行了分析,结果表明,3个厂家的平均蔗糖含量均超出了处方规定量,揭示处方规定辅料用量不合理,未考虑出膏率的变化,建议处方更改为“加蔗糖适量,制成1 000 g”。个别厂家颗粒颜色较深,而蔗糖经高温会发生降解导致颜色加深,提示个别厂家在制粒过程中存在干燥温度过高的问题,建议厂家注意制粒过程中温度的控制。3个厂家的30批样品蔗糖摄入量均超标,建议可研制无糖剂型,增加适用人群。本研究通过测定参麦颗粒色度值及糖类含量,为制备工艺提供参考;通过评估糖摄入量,为指导目标患者合理用药提供指导。