HS-GC-MS法分析三七炮制品中的挥发性成分

杜芹芹,杨成

(1.大连理工大学化工学院,辽宁 大连 116024;2.大连理工大学化学学院,辽宁 大连 116024)

三七是五加科植物人参三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根及根茎,具有散瘀止血,消肿定痛,调节免疫等功效,在治疗心脑血管疾病,抗炎抗肿瘤等方面有较好的应用[1]。三七的化学成分包含皂苷类、多糖类、挥发油类、黄酮类、甾醇类、聚炔醇类、氨基酸类等,其中三七皂苷和三七多糖被认为是主要的活性成分,研究最为广泛[2-4],挥发性成分的研究相对较少[5-6]。三七有生品和熟品之分,目前三七炮制有蒸制、油炸、砂烫、微波等,其中蒸制法以其操作方便、温度易于控制等优点而较为常用[7]。三七在临床应用上素有“生消熟补”之说:生三七偏于活血化瘀、消肿止痛,主要用于降血脂,防止动脉粥样硬化等;熟三七偏于提高免疫、补气养血,主要用于抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节等[8-9]。三七经炮制后成分变化明显,皂苷类成分发生了糖基水解和脱水反应[10-11],总黄酮含量降低,多糖含量增加,与三七熟品补血补气功效增强具有相关性[12]。但目前为止,尚未有从挥发性成分角度对“生消熟补”理论进行研究的相关报道。

顶空进样技术是一种对液体或固体样品中的可挥发性成分进行分析的有效方法,结合气相色谱质谱联用技术用于未知挥发性成分的定性分析,具有简便快速,灵敏度高等特点,目前在生三七挥发性成分的研究中已有应用[13-15],但鲜见于熟三七的应用报道。本研究采用顶空-气相色谱质谱联用技术(HS-GC-MS),建立了三七挥发性成分HS-GC-MS测定方法,明确了三七及其炮制品的挥发性成分组成并比较了其变化,对炮制后成分的变化进行了合理地机理推论,为三七“生消熟补”的药理解释提供挥发性成分的数据依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器7890A-5975C气相色谱质谱联用仪(美国安捷伦公司),配电子轰击(EI)离子源和Combi-PAL多功能进样器(瑞士CTC公司);BS 124 S万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.2 材料生三七(Panaxnotoginseng,PN)购于大连药房 (产地为云南文山,批号:20150802,规格:20头;批号:20211018,规格:30头;批号:20210312,规格30头),药材经大连理工大学李娜副教授鉴定为五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1 样品制备熟三七(SteamedPanaxnotoginseng,S-PN)由同批次生三七经过100 ℃下蒸制3 h,60 ℃真空干燥8 h加工而成[16]。将生、熟三七用粉碎机粉碎后过80目筛,备用。

2.2 顶空提取方法精密称取粉碎后的样品粉末各1.0 g (精确到0.000 1 g),分别放入20 mL顶空进样瓶中,密封后置于样品盘上。样品瓶加热温度为120 ℃,平衡时间为30 min,进样针温度设为100 ℃,进样体积为500 μL。

2.3 气相色谱-质谱条件气相色谱条件:DB-FFAP毛细管色谱柱 (30 m×0.25 mm,0.25 μm),载气为He气,流速为1.0 mL·min-1,分流比为20∶1。进样口温度为250 ℃,初始柱温40 ℃,以10 ℃·min-1的速度升至240 ℃,保持15 min。

质谱条件:EI离子源,电子能量70 eV,离子源温度为230 ℃,四极杆温度为150 ℃,传输线温度为250 ℃.全扫描采集模式,扫描范围m/z 30～500,扫描速率1.94 scans·s-1。

2.4 数据处理采用NIST 11.L谱库进行谱图检索。根据匹配度和文献已报道物质进行比对,选择正匹配度大于800的物质。

2.5 顶空条件优化平衡温度和平衡时间是影响顶空提取效率的两个重要因素。本文考察了80、100、120、140 ℃(平衡时间为30 min)4个温度水平对三七挥发性成分的影响,结果如图1 所示,当平衡温度从80 ℃升到120 ℃时,化合物种类随温度升高而增加,峰强度也随之增强。但温度达到140 ℃时,几乎检测不到化合物,这是因为在140 ℃时,生、熟三七粉末在顶空瓶中结块,影响了挥发性成分的逸出。此外,本试验对平衡温度为120 ℃时不同平衡时间(15、30、45 min)下三七挥发性成分的检出进行了分析,发现目标物的种类和强度随着时间延长而持续增加,30 min以后趋于稳定(结果见图2)。最终确定顶空条件为120 ℃下平衡30 min。

a.80 ℃;b.100 ℃;c.120 ℃;d.140 ℃

a.15 min;b.30 min;c.45 min

2.6 挥发性成分的定性分析生、熟三七在选定条件下的挥发性成分总离子流图如图3所示,从中可以看出它们的差异较大,主要体现在化合物种类和相对含量方面,说明炮制对挥发性成分有着显著影响。通过NIST 11.L标准谱库检索,共鉴定出了126种化合物,采用面积归一化法测定各成分的相对含量,具体如表1所示。

表1 生、熟三七挥发性成分分析

a.生三七;b.熟三七

生三七中检测出103种挥发性成分,包括14种醛类、2种硫化物、3种呋喃衍生物、6种酯类、25种醇类、8种酮类、39种萜烯类、4种烷烃和2种杂环类。其中萜烯类化合物占总物质含量的51.75%,结果与文献报道一致[14]。相对含量超过2%的化合物有6种,依次为α-古芸烯(12.58%)、β-蒎烯(8.34%)、甘香烯(5.53%)、β-荜澄茄油烯(3.80%)、γ-榄香烯(2.30%)、β-依兰烯(2.00%)。本研究中匹配得到乙醛、丙醛、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、丙酮、2-丁酮、2,3-戊二酮、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、甲醇、乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇等15种小分子化合物,推测该部分物质可能是三七成分在顶空高温条件下的裂解或氧化产物。β-榄香烯、β-愈创木烯、γ-杜松烯、β-花柏烯,(+)-瓦伦烯等萜烯异构体也在本研究中首次被鉴定出来。熟三七中检测出126种挥发性成分,包括16种醛类,3种硫化物,8种呋喃衍生物,7种酯类,27种醇类,9种酮类,9种含氮化合物,1种酸类,39种萜烯类,5种烷烃和2种杂环类。由表1和图4可以看出,三七炮制后挥发性成分变化主要为醇类,酮类化合物种类增多,新生成含氮化合物和乙酸,呋喃衍生物种类和相对含量均明显增加,萜烯类成分略有损失,α-蒎烯、β-蒎烯相对含量明显降低。

图4 生、熟三七挥发性成分比较

3 讨论

预试验中尝试采用顶空瓶中加溶剂后提取三七中挥发性成分,效果不理想。故试验过程中是直接对三七粉末进行顶空提取。熟三七经过高温蒸制和低温烘干等热处理后,有部分挥发性成分相对含量明显变化,推测是因为在炮制过程中损失,或者转化为与其结构相似的化合物[17]。生三七中α-蒎烯,β-蒎烯是检出较多的萜烯类成分。研究表明,蒎烯具有较强的抗肿瘤和抗真菌活性,可增强抗生素对弯曲杆菌的抑制作用,诱导大鼠产生抗惊厥和抗氧化作用,同时具有镇痛,抗过敏以及趋避昆虫等药物活性[18-20]。这可能与生三七在消肿止痛,活血化瘀方面具有显著功效相关。而熟三七中蒎烯相对含量较低,导致熟三七在消炎方面的药理活性减弱。熟三七中3-糠醛含量较高 (1.14%),新生成的呋喃类衍生物、乙酸、羟基丙酮、1,2-丁二醇以及含氮杂环化合物等17种物质是其特有的成分,推测均与生三七炮制过程中发生美拉德反应有关。生三七中含有多种糖和游离氨基酸[21],具有发生美拉德反应的物质基础,熟三七的热处理炮制过程则为美拉德反应的发生提供了必要的外部条件。熟三七中的特有挥发性物质,如醛类,羰基类,杂环类化合物,大多产生于美拉德反应的中间阶段,即为烯醇化反应产物或Strecker降解产物。研究表明,美拉德反应产物具有显著的抗氧化活性,可抑制血管紧张素Ⅰ转化酶的活性,降低血压,保护心肺功能,可通过刺激多种免疫细胞的自然产生来增强天然免疫和适应性免疫[22-23]。熟三七中美拉德反应产物的相对含量较高(7.08%),可能是熟三七发挥其补益,增强免疫功效的物质基础之一。对于生熟三七的药理活性差异与炮制过程中挥发性成分的具体相关性还需要进一步的药理实验证明,这是后续将进行的工作。

本文通过顶空-气相色谱质谱联用方法检测了生、熟三七中的挥发性成分,共鉴定出126种化合物;对三七炮制前后的挥发性成分变化进行分析并对其产生机理进行合理推断,发现熟三七中萜烯类化合物含量明显降低,同时新生成了多种美拉德中间反应产物,这有助于多维度评价三七炮制工艺。结合已报道的化合物的生物活性,从挥发性成分角度阐释“生消熟补”的作用机制,为三七的炮制规范提供重要的数据支持,为三七的深度开发应用提供化学依据。但目前三七炮制工艺并未形成规范,对不同炮制过程中挥发性成分的多维变化也还需要更进一步的分析研究。