高效液相色谱法测定化妆品中吡硫鎓锌等19种组分的不确定度评定

黄炯力，范菲，王喻，王为梁

（1.西安计量技术研究院，西安 710068；2.西安市食品药品检验所，西安 710054）

《化妆品安全技术规范》[1]（2015年版）将吡硫鎓锌、水杨酸、山梨酸、苯氧异丙醇、2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、对氯间甲酚、2,4-二氯苯甲醇、邻苯基苯酚、邻伞花烃-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、苄氯酚、吡罗克酮乙醇胺盐、三氯卡班、三氯生、溴氯芬、硫柳汞钠等19种化合物列为防腐剂限用成分，并规定了高效液相色谱法测定化妆品中吡硫鎓锌等19种组分含量的方法[2-4]，对组分含量的准确测定是保障化妆品质量安全的重要保证。测量不确定度是对测量结果质量的定量表征，其测量结果的可信度和可用性很大程度上取决于其不确定度的大小[5-11]。所以，测量结果数据应该附有测量不确定度说明才是完整并有意义的。考虑到上述的影响因素和测量过程的不确定性，笔者参考相关文献[12‒15]，对吡硫鎓锌等19 种组分的高效液相含量测定方法建立了数学模型，进行了不确定度评定，为检验结果评定的准确性和合理性，提供一定参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：ULTIMATE U-3000 型，二极管阵列检测器，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

电子天平：(1) BSA124S-CW 型，分度值为0.1 mg，德国赛多利斯科学仪器有限公司，(2) MS105型，分度值为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

高速冷冻离心机：HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

涡旋混匀器：V2S025 型，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

吡硫鎓锌、山梨酸、三氯卡班、溴氯芬标准品：质量分数分别为99.8%、99.9%、99.4%、99.6%，北京曼哈格生物科技有限公司。

水杨酸、苯氧异丙醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、三氯生标准品：质量分数分别为99.9%、99.8%、99.16%、99.46%、99.90%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、对氯间甲酚、2,4-二氯苯甲醇、邻苯基苯酚、邻伞花烃-5-醇、苄氯酚、吡罗克酮乙醇胺盐、硫柳汞钠标准品：质量分数分别为100.00%、99.60%、98.52%、99.08%、98.23%、99.94%、99.85%、99.02%、99.86%、98.8%，美国Stanford Chemicals 公司。

化妆品样品：洗发乳，市售。

甲醇、乙腈：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

实验所用其它试剂均为分析纯。

实验用水为高纯水。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：Thermo Acclaim TM 120-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司)；柱温：30 ℃；流动相：(A)磷酸二氢钠溶液(pH值3.80)，(B)甲醇溶液，流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，0.0～5.0 min 80%～55% A，5.0～15.0 min 55%A，15.0～32.0 min 55%～30% A，32.0～47.0 min，30%～15% A，47.0～54.0 min 15% A，54.0～55.0 min 15%～55% A，55.0～60.0 min 55% A，60.0～60.1 min 55%～80% A，60.1～65.0 min 80% A；检测波长：吡硫鎓锌、水杨酸、山梨酸、苯氧异丙醇、邻伞花烃-5-醇、氯二甲酚、三氯卡班、三氯生的测定采用280 nm，2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、对氯间甲酚、2,4-二氯苯甲醇、邻苯基苯酚、氯咪巴唑、苄氯酚、溴氯芬、硫柳汞钠的测定采用230 nm，吡罗克酮乙醇胺盐的测定采用300 nm；进样体积：10 μL。

1.3 溶液制备

17种组分的混合标准储备溶液：精密称取除硫柳汞钠、吡硫鎓锌以外的17 种组分标准品适量，置于同一20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，摇匀。

吡硫鎓锌标准储备溶液：1.00 mg/mL，精密称取吡硫鎓锌标准品100 mg，置于100 mL 容量瓶中，先加入20 mL 二甲亚砜溶解，再用甲醇定容至标线，摇匀。

硫柳汞钠标准储备溶液：2.5 mg/mL，精密称取硫柳汞钠标准品50 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，摇匀。

18种组分的混合标准系列溶液：分别精密量取17 种组分的混合标准储备溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，吡硫鎓锌标准储备溶液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mL，分别置于6只50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，摇匀。

硫柳汞钠系列标准工作溶液：分别精密量取硫柳汞钠标准储备溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mL，置于6只50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，摇匀。

化妆品样品溶液A：准确称取样品1.0 g (精确至0.001 g)，置于50 mL 具塞比色管中，加入甲醇8 mL，涡旋振荡30 s，使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min，用甲醇定容至10 mL，摇匀，以10 000 r/min 离心5 min。上清液经0.22 μm 滤膜过滤，即得。该溶液用于测定除吡硫鎓锌外的18 种组分。

化妆品样品溶液B：准确称取样品0.5 g (精确至0.001 g)，置于50 mL具塞比色管中，加入乙腈-甲醇(体积比为95∶5) 40 mL，涡旋振荡30 s，使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min，用乙腈-甲醇(体积比95∶5)定容至50 mL，摇匀，以10 000 r/min离心5 min。取上清液经0.22 μm 滤膜过滤，即得。该溶液用于测定样品中的吡硫鎓锌。

1.4 实验步骤

按1.2 色谱条件，取混合标准系列溶液分别进样，进行色谱分析，以标准系列溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。取样品溶液进样，进行色谱分析，根据保留时间和紫外光图谱定性，测得色谱峰面积，以标准曲线法得到待测溶液中各测定组分的浓度，计算样品中各待测组分的含量。

2 数学模型

2.1 数学模型建立

根据保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中吡硫鎓锌等19种组分的质量浓度，按式（1）计算其中的含量。

式中：w——化妆品中待测组分的质量分数，μg/g；

m——样品称取质量，g；

ρ——从标准曲线得到的目标组分质量浓度，μg/mL；

V——样品定容体积，mL。

2.2 测量不确定度来源

根据测定数学模型分析，其测量不确定的来源主要有：

（1）标准物质引入的不确定度：标准物质称量引入的不确定度u(ms)、玻璃量器移液定容引入的不确定度u(Vs)及由标准曲线拟合引入的不确定度u(L)；

（2）样品引入的不确定度：样品称量引入的不确定度u(mx)、样品定容引入的不确定度u(Vx)；

（3）高效液相色谱仪引入的不确定度u(D)；

（4）样品测量重复性引入的不确定度u(f)。

测量模型中输入量估计值相互独立，采用相对标准不确定度合成公式计算：

由上式可推导出被测样品的相对标准不确定度合成公式（2）为：

3 测量不确定度分量的量化

3.1 标准物质引入的相对标准不确定度

3.1.1 标准物质称量引入的相对标准不确定度urel(ms)

标准物质称量采用分度值为0.01 mg 的电子天平，其测量不确定度分量应包括天平最大示值误差、重复性、分辨力及偏载等的影响，但考虑为单次称量，重复性、分辨力及偏载等影响均包含在最大示值误差内，故主要考虑天平最大示值误差引入的标准不确定度u(ms,1)。此外，环境温度、大气浮力、重力加速度可忽略不计。根据计量检定证书结果，天平最大允许误差为±0.05 mg，则其区间半宽为0.05 mg，估计为均匀分布，包含因子k=2，对其标准不确定度进行计算，得到u(ms,1)=2.89×10-2mg。

由于采用差减法称量，存在2次读数，因此标准物质称量引入的标准不确定度为：

称取质量为ms，则标准物质称量质量引入的相对合成标准不确定度按式（3）计算，结果见表1。

表1 称量引入的相对标准不确定度

3.1.2 玻璃量器移液定容引入的相对标准不确定度u(Vs)

玻璃量器移液定容引入的不确定度分量基本由三部分组成：容量允差u(V1)及溶剂体积膨胀系数u(V2)的影响。

由以上2项合成得出相对合成标准不确定度：

其它玻璃量器移液定容引入的不确定度计算同上，结果见表2。

表2 各玻璃量器引入的相对标准不确定度

3.1.3 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(L)

精密吸取标准系列工作溶液，分别进样测定，以色谱峰平均面积与标准溶液浓度用最小二乘法进行拟合，由线性方程计算样品溶液平均质量浓度产生的标准不确定度由式（4）计算：

式中：s(A)——标准溶液色谱峰面积的标准偏差，9.08；

ρx——样品溶液的平均质量浓度,μg/mL；

ρˉ——系列标准工作溶液的平均质量浓度，μg/mL；

A——线性方程斜率；

N——样品平行测定次数，N=2；

n——标准溶液测定次数，n=6×2。

将上述各值代入公式得出u(L)，得标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

计算结果见表3。

3.2 样品引入的不确定度

3.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(mx)

配制化妆品样品溶液A、化妆品样品溶液B，分别取样两份。配制样品溶液A样品称取质量分别为1.012 3、1.024 6 g，则称量结果引入的相对合成标准不确定度为urel(mx)=2.53×10-3。

配制样品溶液B 样品称取质量分别为0.506 4、0.517 8 g，则称量引入的相对合成标准不确定度为1.50×10-3。

3.2.2 样品溶液定容引入的相对标准不确定度urel(Vx)

同理，测定吡硫鎓锌时使用50 mL 比色管的相对合成标准不确定度为5.11×10-3。

3.3 高效液相色谱仪引入的相对标准不确定度urel(D)

由检定证书可知，高效液相色谱仪DAD检测器的定量测量误差为0.05%，即其相对扩展不确定度为0.05%，按均匀分布计算，k= 3，则相对标准不确定度为：

3.4 测量重复性引入的相对标准不确定度urel(f)

在重复条件下，精密称取6份样品各测定2次（n=6，N=2），实验结果按式(5)和式(6)计算，标准不确定度结果见表4。

表4 样品重复性测定结果

3.5 测量结果的不确定度

将以上各不确定度分量的值代入式(2)计算6份化妆品中吡硫鎓锌等19种组分的质量分数均值w，取包含因子k=2(置信概率95%)，则液相色谱法测定化妆品中吡硫鎓锌等19 种组分的相对扩展不确定度按式(8)和式(9)计算：

高效液相色谱法测定化妆品中吡硫鎓锌等19种组分的质量分数及相对扩展不确定度(k=2)见表5。

表5 化妆品中吡硫鎓锌等19种组分的含量

4 结语

通过对各分量不确定度的考察表明，高效液相色谱法测定化妆品中吡硫鎓锌等19 种组分，7 个不确定度来源对测定结果的影响较大，其中标准物质称重、玻璃量器移液定容和标准曲线引入的不确定度分量为合成不确定度的主要贡献量，标准物质纯度、重复性、样品称量和液相色谱仪引入的不确定度分量相对较小，可采用配制的工作曲线标准点尽量与被测组分浓度接近，增加系列标准工作溶液实验点数，定期对仪器及量器进行检定和维护，使其保持较高灵敏度等，降低相应测量不确定度分量对测量结果的影响，对于基质相对复杂的样品，可采用内标法等方法进行测定，降低样品基质引入的不确定度。