酶标分析仪检定用中性滤光片的校准

赵雷，张江东，刘素梅

（1.浙江省计量科学研究院，杭州 310018；2.浙江省能源与环境保护计量检测重点实验室，杭州 310018）

酶标分析仪工作原理是依据酶标记的免疫复合物与酶的相应底物产生显色反应，显色程度与被测样品中待测抗体(或抗原)的含量相关，根据显色物吸光度值确定待测物质含量，不同待测物质有其各自的特征吸收谱线，并遵守郎伯-比耳定律，据此对待测物质进行定量分析[1]。酶标分析仪在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学等领域中得到广泛应用[2‒4]。酶标分析仪本质为一台光电比色计或分光光度计，其工作原理与主要结构和光电比色计基本相同，其中标准中性滤光片是保证酶标分析仪量值准确可靠的关键[5‒10]。

目前，国家仅有的光谱光度滤光器检定规程为JJG 1034—2008《光谱光度计标准滤光器检定规程》，尚没有对特征值为吸光度的标准中性滤光片的计量特性进行规范。为确保酶标分析仪量值传递的准确可靠，结合多年的滤光片校准工作，笔者对酶标分析仪检定用标准中性滤光片的校准方法及校准结果进行了研究和探讨，并对滤光片的使用和维护提出意见和建议。

1 酶标分析仪检定用中性滤光片技术要求

现行的酶标分析仪检定依据为JJG 861—2007《酶标分析仪检定规程》，该规程规定检定用标准中性滤光片的吸光度标称值分别为0.2、0.5、1.0、1.5，扩展不确定度(U)不大于0.01(k=2)。

2 酶标分析仪检定用中性滤光片的校准方法

2.1 校准条件

酶标分析仪检定用中性滤光片，作为光谱光度计标准滤光片的一种，其校准条件应满足JJG 1034—2008《光谱光度计标准滤光器检定规程》的要求[11]。

2.1.1 校准设备

采用经检定合格的Ⅰ级紫外可见分光光度计，其计量技术指标满足JJG 1034—2008《光谱光度计标准滤光器检定规程》的要求，即波长分辨力优于0.05 nm，波长示值误差优于±0.2 nm，特征波长点的透射比示值误差优于±0.001，杂散辐射水平低于1×10-5，测量的光谱范围能覆盖开展工作所需的光谱范围。

2.1.2 校准环境

校准的环境温度为(23±5) ℃，相对湿度不大于65%，保存和工作环境中无可引起标准中性滤光片变化的气体。

2.1.3 校准项目

滤光片被广泛应用于光学仪器的性能评价，其计量性能指标主要有特征波长下的吸光度值、吸光度均匀性、吸光度年变化量、吸光度正反面检测差值等[7,11-15]。

2.1.4 校准前准备

对中性滤光片表面进行清洁处理，可用洗耳球吹净表面浮尘，对污染严重的滤光片可用体积比为1∶4 的乙醇和乙醚混合溶液擦净表面，但该操作可能会影响滤光片的年变化量。

将紫外可见分光光度计调整为吸光度模式，设置波长点分别为405、450、490、492、540、620、630 nm，也可根据被检酶标仪的特有专一波长给出中性滤光片的吸光度值。以空气作参比，进行基线校正，并测量0%吸光度。

2.1.5 特征波长下的吸光度测量

将被校滤光片置于样品槽中，以空气作参比，读出特征波长点下的吸光度值，重复6 次，分别按式(1)、式(2)计算测量值的算术平均值和标准偏差，要求同一波长点下的6次测量吸光度算术平均值的相对标准偏差应小于0.03%，否则应重新测量[11]；以6次测量结果的算术平均值作为该滤光片的吸光度值。

式中：A——吸光度测量值；

n——测量次数，n=6；

Ai——第i次吸光度测定值；

Aˉ——吸光度测量值的平均值；

s——6次测量的吸光度值的标准偏差。

2.1.6 吸光度正反面检测差值

分别测量入射光从中性滤光片正面中心点摄入、从背面中心点射入时紫外可见分光光度计的吸光度值，计算二者的差值，取其绝对值。

2.1.7 吸光度均匀性

在中性滤光片中心点及距中心点上下各5 mm处，分别测量特征波长点的吸光度值。计算三处吸光度值的差值，取其绝对值。

2.1.8 吸光度年变化量

计算同一中性滤光片两次校准(间隔一年)对应特征波长点吸光度差值的绝对值。

3 校准实例及不确定度评定

目前，酶标分析仪检定用中性滤光片的生产机构主要有中国计量科学研究院、国防科技工业应用化学一级计量站、黑龙江省计量科学研究院、吉林省计量科学研究院等，其吸光度扩展不确定度U=0.005～0.012，k=2。笔者选用一套正常使用的酶标分析仪检定用中性滤光片，对前述校准方法进行验证。

笔者所在机构建有光谱光度滤光器检定装置，为全省最高社会公用计量标准。本次校准方法的研究和探讨使用该计量标准。使用经检定合格的Ⅰ级紫外可见分光光度计，型号为Cary5000。

3.1 校准结果

将该套滤光片进行外观检查，并吹去浮尘，符合校准要求。将分光光度计按要求设置、预热，待仪器稳定且符合使用要求后，依次将滤光片放入光路连续测量，每个特征波长点均测量6次，计算结果见表1。从计算结果可以看出，该组滤光片在所有波长点下的6次测量结果的相对标准偏差均小于0.03%，满足校准方法的要求，吸光度值测量重复性良好，测量结果可信，6 次测量结果的算术平均值为该滤光片的吸光度值。

表1 中性滤光片吸光度值测量结果

接着对该组滤光片进行均匀性、正反面差异检测计算，同时调取上一年的校准结果，计算吸光度值年变化量，校准结果见表2。从表2 可以看到，该组滤光片在各波长点的均匀性最大值为0.002，正反面差异最大值为0.001，吸光度年变化量最大值为0.004，可知该组滤光片的吸光度均匀性、吸光度年变化量均能够满足使用要求[1]。

表2 中性滤光片均匀性、正反面差异、年变化量校准结果

3.2 不确定度评定

根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[16]，以标称值为1.0的滤光片为例，对上述滤光片620 nm波长下的测量结果进行测量不确定度评定。对滤光片的测量过程进行分析可知，测量不确定度的来源有：测量重复性、分光光度计透射比误差、分光光度计杂散辐射、中性滤光片年稳定性、中性滤光片均匀性[13,15,17]。

3.2.1 测量重复性引入的标准不确定度分量u1

对该滤光片吸光度进行连续6 次测量，得到的测量值分别为：1.065、1.064、1.064、1.064、1.064、1.065，采用A 类评定，根据贝塞尔公式计算单次测量的标准偏差s=5.2×10-4，即u1=5.2×10-4。

3.2.2 分光光度计透射比误差引入的标准不确定度分量u2

3.2.3 分光光度计杂散辐射引入的不确定度分量u3

3.2.4 中性滤光片年稳定性引入的不确定度分量u4

在本次校准中，标称值为1.0 的滤光片在620 nm处的吸光度年稳定性为0.004，按B类评定，符合正态分布，取k=2，得u4=0.002。

3.2.5 中性滤光片均匀性引入的不确定度分量u5

在本次校准中，标称值为1.0 的滤光片在620 nm处的吸光度均匀性为0.001，按B类评定，符合均匀分布，取k= 3，得u5=5.8×10-4。

3.2.6 合成标准不确定度

以上各影响量相互独立，则合成标准不确定度为：

3.2.7 扩展不确定度

取包含因子k=2，则：

3.3 校准结果分析

中性滤光片吸光度值校准结果的不确定度为：U=0.005(k=2)。该结果表明，按该方法校准的中性滤光片的校准结果能够符合JJG 861—2007 对中性滤光片的要求[1]，即不确定度不大于0.01(k=2)，可以开展酶标分析仪吸光度值相关项目的校准工作。

3.4 校准过程中存在的问题探讨

在对检定酶标分析仪用中性滤光片校准过程中发现，滤光片的表面容易沾染灰尘、指印乃至出现磨损，究其原因，主要是其在校准过程中要将滤光片按通道固定于96孔板，为水平放置，容易污损。但是，此类污损容易对吸光度的结果产生影响，特别是对吸光度值均匀性、吸光度值年变化量产生影响，继而会对酶标分析仪校准的吸光度示值误差、吸光度重复性、通道差异等产生直接影响。因此，在使用滤光片过程中，应当尽可能小心拿放，同时还得注意外部的环境，避免衣服的拉链、纽扣等划到滤光片，使用前后应用干净的洗耳球吹去表面浮尘，并放入保存盒中。在取放滤光片的时候，手拿滤光片支架边缘，戴着指套/手套也不要去接触滤光片的表面。在校准酶标分析仪的过程中，特别是在客户现场实验室，要特别注意滤光片应该被放在柔软干净的物体上，切忌放在玻璃、金属、桌子或者不干净的纸上，避免客户现场实验室的试剂等污染。如果发现滤光片表面有脏污，必须马上清洁。灰尘会很容易使滤光片表面被刮花，手指等接触遗留的酸性物质可能会与滤光片材料发生化学反应，污损滤光片表面。必要时可以用无水乙醇或者类似的功能溶剂去进行擦拭污点和指印。及时做好滤光片的期间核查，如对数据产生怀疑时，要及时送技术机构校准。

4 结语

酶标分析仪检定用中性滤光片校准的主要项目为：特征波长下的吸光光度值、吸光度均匀性、吸光度年变化量、吸光度正反面检测差值。分析校准过程和不确定度评定，结合酶标仪量值传递需求(酶标分析仪吸光度允许值为±0.03)，吸光度均匀性、吸光度正反面检测差值均应不大于0.005，吸光度年变化量应小于0.010。

校准结果的不确定度评定表明，按该方法校准的中性滤光片的校准结果能够符合JJG 861—2007对中性滤光片的要求，即不确定度不大于0.01(k=2)，可以开展酶标分析仪吸光度值相关项目的检定和校准工作。