红花黄色素对TREM2沉默的APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响

郑艳杰,张梦玉,范艳慧,叶红霞,齐妍强,贺颖西,胡艳丽*

(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832002;2 石河子市人民医院,新疆 石河子 832000)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种进行性神经退行性疾病,主要的病理特征为细胞外由β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉积所形成的老年斑(Semile plaque,SP)和细胞内由微管相关蛋白Tau (Microtubule-associated protein,Tau)过度磷酸化所形成的神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)[1]。近年来研究发现,小胶质细胞活化诱导的慢性神经炎症反应是AD的主要病因之一[2]。髓样细胞2触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是小胶质细胞活化过程中的关键蛋白之一,其可抑制小胶质细胞释放促炎因子如白介素-1β (IL-1β)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等,并且上调白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)等抑炎因子的表达,从而减轻神经炎症对脑细胞的损伤作用[3]。

红花黄色素为红花主要活性成分,课题组前期研究显示,在多种 AD 动物模型中,红花黄色素具有较好改善痴呆动物学习、记忆的作用[4-5]。本研究通过建立TREM2基因沉默的APP/PS1小鼠模型,深入研究TREM2对小胶质细胞活化和炎症因子释放的调控机制,进一步阐明TREM2在SY改善 APP/PS1小鼠脑组织病理进程中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

1.1.1 实验动物

选用6月龄WT小鼠10只;同月龄APP/PS1小鼠(Tg)70只。所用小鼠购买于南京君科生物科技有限公司。实验动物使用许可证号:20180006018886。所有动物操作均严格遵守实验动物的人道关怀和使用的指导方针。

1.1.2 实验药物

LV-TREM2-RNAi、LVCON313(上海吉凯基因化学技术有限公司,批号:0019856);红花黄色素(云南通海杨氏天然产物公司,批号:YSCMY20200710);盐酸多奈哌齐片(Donepezil,DP卫材中国药业有限公司,批号:1601044) 。

1.1.3 实验主要试剂

白介素6(IL-6)、γ 干扰素(IFN-γ)、白介素10(IL-10) ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:m1002293V、m1002277V、m1037873V);白介素4(IL-4)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,批号:12717122411);6E10 (Biolegend,批号:803004);Iba-1抗体(Affinity, 批号:DF6442);TLR4 抗体(Santa Cruz Biotechnology,批号:J3119);NF-κB p65抗体、p-NF-κB p65抗体(Affinity,批号:AF5006、AF2006) 。

1.1.4 仪器

DMS-2型 Morris 水迷宫、DTT-2型小鼠跳台仪、SBA-2型小鼠避暗仪 (中国医学院科学院药物研究所);Thermo 3001酶标仪 (德国 ZEISS 公司);电泳仪,电转仪(美国 BIO-RAD 公司);LSM510正置显微镜 (Zeiss 公司);EC3510型UVP 化学发光成像系统(美国 UVP 公司) 。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及给药

6月龄Wide Type小鼠10只,即WT组;同月龄Tg小鼠70只随机分为7组,即 Tg组、TREM2基因沉默即转染沉默TREM2基因的慢病毒(Tg+LV)组、阴性对照即未转染沉默TREM2基因的空白载体病毒 (Tg+LV-C)组、Tg+LV+SY 30 mg·kg-1组、Tg+LV-C+SY 30 mg·kg-1组、Tg+LV+DP 0.75 mg·kg-1组、Tg+LV-C+DP 0.75 mg·kg-1组。

建立慢病毒介导的TREM2基因沉默的APP/PS1小鼠模型:小鼠术前12 h禁食。用1% 水合氯醛(3.5 mL·kg-1)将小鼠麻醉,将其固定在脑立体定位仪上,根据小鼠脑立体定位图谱,坐标为:前囟后0.5 mm,中线旁1 mm,膜下2.5 mm,其中WT组和Tg组注射生理盐水,Tg+LV组、Tg+LV+SY 30 mg·kg-1组及Tg+LV+DP 0.75 mg·kg-1组用微量注射器吸取2.5 μL转染沉默TREM2基因的慢病毒,Tg+LV-C组、Tg+LV-C+SY 30 mg·kg-1组及Tg+LV-C+DP 0.75 mg·kg-1组用微量注射器吸取2.5 μL未转染沉默TREM2基因的空白载体病毒缓慢注入小鼠右侧侧脑室,注射时间5 min,留针5 min,缝合切口。术后给予青霉素钠腹腔注射,并观察小鼠的生命体征。造模7 d后,WT组、Tg组、Tg+LV组及Tg+LV-C组灌胃生理盐水,治疗组分别灌胃SY 30 mg·kg-1,DP 0.75 mg·kg-1,每日一次,连续给药3个月。

1.2.2 水迷宫实验

进行实验前往水中加入奶粉,使其呈乳白色不透明状,水温保持 (20±2)℃ 。Morris 水迷宫实验共6 d。前五天为定位航行实验,水池分为 4 个象限区,平台设于固定象限中心,小鼠每天从相对和相邻象限入水,记录小鼠找到平台的时间。第六天进行空间探索实验,移去平台,小鼠从选定象限入水,记录小鼠在120 s 内穿越平台的次数。

1.2.3 避暗实验

实验进行2 d。第一天学习训练阶段,将小鼠背对洞口放入明室内适应3 min后取出,通电后,将小鼠背对着洞放入明室,小鼠多有趋暗避明的习性,会主动由明室通往暗室,进入暗室受到电击后会迅速逃回明室,从而产生记忆。第二天测试阶段,将小鼠背对洞口放入明室,记录5 min内小鼠从明室进入暗室的潜伏期以及进入暗室的次数。

1.2.4 跳台实验

实验连续进行2 d 。第一天学习训练阶段,将小鼠放入实验箱适应环境3 min之后进行通电,小鼠受到电击后,其正常逃避反应是跳上橡皮台避免电击。第二天测试阶段,通电后,按照前一天操作将小鼠放于绝缘台上,记录3 min内小鼠第一次跳下平台的时间及跳下平台次数即错误次数。

1.2.5 免疫组化

脑组织石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复、用3%的H2O2孵育,分别滴加一抗6E10(1∶500),Iba-1(1∶100),4 ℃孵育过夜,二抗孵育30 min、DAB显色、返蓝、酒精梯度脱水、中性树脂封片,显微镜下拍摄脑组织的皮层区及海马区,使用Image J软件分析统计各显微照片阳性区域。

1.2.6 ELISA试剂盒检测炎症因子含量

行为学实验结束后,快速断头取脑,取小鼠皮层组织,按组织(mg):PBS(μL)比例为1∶9加入PBS制成匀浆,4 ℃,5000×g离心10 min,取匀浆上清冻存待测。依据IL-6、INF-γ、IL-4、IL-10 ELISA试剂盒说明书方法检测炎症因子含量。

1.2.7 Western Blot 检测皮层组织TREM2、TLR4、 p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达

行为学实验结束后,冰上分离皮层,冻存于-80 ℃备用,精确称取相对质量的皮层组织,按照RIPA裂解液(μL):组织(mg):PMSF蛋白酶抑制剂(μL)比例为100∶10∶1,匀浆提取总蛋白,蛋白测定仪Q5000 测定蛋白浓度,加入电泳液和4×上样缓冲液,配制成5 μg·μL-1的蛋白样品。混匀后煮沸5 min,冷却后分装于-20 ℃备用。根据目的蛋白分子量大小,蛋白变性后进行电泳分离蛋白,转膜,室温封闭,孵育对应一抗(TREM2、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65),抗体稀释浓度均为 1∶1 000,4 ℃ 过夜,第二天,TBST洗涤后,小鼠/兔二抗(1∶10 000)室温孵育 1 h,显影拍照,UVP 对条带进行信号收集。

1.2.8 统计学方法

2 结果

2.1 Morris 水迷宫

定位航行实验结果表明,与WT组小鼠相比,Tg组小鼠从训练第二天起潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01),提示Tg组小鼠出现空间学习障碍;与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠潜伏期有延长的趋势;与Tg+LV组小鼠相比,SY及DP组小鼠潜伏期有缩短的趋势;与Tg+LV-C组小鼠相比,SY组小鼠潜伏期明显缩短(P<0.05或P<0.01),DP组小鼠潜伏期显著缩短(P<0.01) 。空间探索实验结果显示,Tg组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间显著少于WT组(P<0.01);与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠穿越平台次数有减少的趋势,目标象限停留时间有减少的趋势;与Tg+LV组小鼠相比,SY及DP组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间明显增加(P<0.05或P<0.01);与Tg+LV-C组小鼠相比,SY及DP组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间显著增加(P<0.01) (表1,表2) 。

表1 红花黄色素对TREM2基因沉默的APP/PS1小鼠逃避潜伏期的影响

表2 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠空间探索能力的影响

2.2 避暗实验

与WT组小鼠比较,Tg组小鼠的潜伏期显著缩短(P<0.01),错误次数显著增加(P<0.01);与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠潜伏期显著缩短(P<0.01),错误次数显著增加(P<0.01);与Tg+LV组小鼠相比,SY及DP组小鼠潜伏期显著延长及错误次数减少(P<0.01);与Tg+LV-C组小鼠相比,SY及DP组小鼠潜伏期显著延长及错误次数减少(P<0.01) (图1) 。

与WT组相比,*P<0.05,**P<0.01; 与Tg组相比,aP<0.05,aaP<0.01; 与Tg+LV组相比,#P<0.05,##P<0.01; 与Tg+LV-C组相比,△P<0.05,△△P<0.01。图1 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠避暗实验逃避潜伏期(A)和错误次数(B)的影响

2.3 跳台实验

与WT组小鼠比较,Tg组小鼠潜伏期显著缩短(P<0.01),错误次数显著增加(P<0.01);与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠的潜伏期明显缩短(P<0.05),错误次数显著增加(P<0.01);与Tg+LV组小鼠相比,SY及DP组小鼠潜伏期显著延长及错误次数显著减少(P<0.01);与Tg+LV-C组小鼠相比,SY及DP组小鼠潜伏期显著延长及错误次数显著减少(P<0.01) (图2) 。

与WT组相比,*P<0.05,**P<0.01; 与Tg组相比,aP<0.05,aaP<0.01; 与Tg+LV组相比,#P<0.05,##P<0.01; 与Tg+LV-C组相比,△P<0.05,△△P<0.01。 图2 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠跳台实验潜伏期(A)和错误次数(B)的影响

2.4 SY对 TREM2基因沉默的APP/PS1小鼠皮层和海马组织病理学的影响

通过免疫组织化学染色,Aβ被标记为棕褐色。与WT组小鼠比较,Tg组小鼠皮层及海马组织区中Aβ斑块水平显著升高(P<0.01);与Tg组小鼠比较,Tg+LV组小鼠皮层及海马组织中Aβ斑块水平显著升高(P<0.01),Tg+LV-C组小鼠皮层及海马组织中Aβ斑块水平无统计学差异;与Tg+LV组相比,给药组小鼠皮层及海马组织中Aβ斑块水平显著降低(P<0.01);与Tg+LV-C组相比,SY组小鼠皮层及海马中Aβ斑块水平明显降低,DP组小鼠皮层及海马中Aβ斑块水平明显降低(P<0.05或P<0.01);Tg+LV-C+SY组Aβ阳性表达水平低于Tg+LV+SY组,表明SY可能是通过调节TREM2表达起到一定的改善效果(图3) 。

2.5 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠皮层和海马组织中 Iba-1表达的影响

通过免疫组织化学染色,活化的小胶质细胞(Microglia,MG)被标记为胞体变大并带有突起的棕色阳性细胞。与WT组小鼠相比,Tg组小鼠脑组织中Iba-1表达显著增加(P<0.01),提示有大量活化的MG;与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠脑中Iba-1表达显著增加(P<0.01),说明MG活化程度增加,Tg+LV-C组小鼠脑中Iba-1表达无统计学差异;SY及DP给药后显著降低了Tg+LV组小鼠皮层和海马各区Iba-1表达(P<0.01);与Tg+LV-C组相比,SY组小鼠皮层和海马各区中Iba-1表达有下降的趋势,DP组小鼠皮层和海马各区的Iba-1表达显著下降(P<0.01);治疗组中Tg+LV-C+SY组Iba-1表达低于Tg+LV+SY组,表明SY可能是通过调节TREM2表达起到改善作用 (图4) 。

2.6 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠脑内炎症因子含量的影响

与WT组小鼠相比,Tg组小鼠皮层中 IL-6、IFN-γ的含量明显升高(P<0.05或P<0.01),IL-4、IL-10的含量明显减少(P<0.05或P<0.01);与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠皮层中IL-6、IFN-γ 含量明显升高(P<0.05或P<0.01),IL-4、IL-10含量有下降的趋势;与Tg+LV组小鼠相比,SY和DP组小鼠皮层中IL-6、IFN-γ含量明显降低(P<0.05或P<0.01),IL-4含量显著升高(P<0.01),IL-10含量有升高的趋势;与Tg+LV-C组小鼠相比,SY和DP组小鼠皮层中IL-6含量显著下降(P<0.01),IFN-γ含量有下降的趋势,IL-10含量有升高的趋势,SY组小鼠皮层中IL-4含量有升高的趋势,DP组小鼠皮层中IL-4含量显著升高(P<0.01) 结果见表3 。

表3 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠皮层IL-6、IFN-γ、IL-4和IL-10水平的影响

2.7 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠皮层中TREM2、TLR4、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表达的影响

与WT组小鼠相比,Tg组小鼠TREM2蛋白表达降低,TLR4表达有升高趋势;与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠皮层中TREM2蛋白表达明显下降(P<0.05),TLR4表达有升高趋势;与Tg+LV组小鼠相比,SY组及DP组小鼠皮层中TREM2蛋白表达显著升高(P<0.01),TLR4蛋白表达显著下降(P<0.01);与Tg+LV-C组相比,SY及DP组小鼠TREM2蛋白表达显著升高(P<0.01),TLR4表达显著下降(P<0.01)(图5)。

与WT组相比,*P<0.05,**P<0.01; 与Tg组相比,aP<0.05,aaP<0.01; 与Tg+LV组相比,#P<0.05,##P<0.01; 与Tg+LV-C组相比,△P<0.05,△△P<0.01。图5 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠皮层TREM2、TLR4蛋白表达的影响

与WT组小鼠相比,Tg组小鼠组p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达有升高趋势;与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠皮层中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达明显升高的趋势;与Tg+LV组小鼠相比,SY组小鼠皮层中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达明显下降(P<0.05),DP组小鼠皮层中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著下降(P<0.01);与Tg+LV-C组相比,SY及DP组小鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达有下降的趋势(图6) 。

与WT组相比,*P<0.05,**P<0.01; 与Tg组相比,aP<0.05, aaP<0.01; 与Tg+LV组相比,#P<0.05,##P<0.01; 与Tg+LV-C组相比,△P<0.05,△△P<0.01。图6 SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠皮层p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达的影响

3 讨论

AD是痴呆的主要类型之一,主要表现为进行性记忆和认知功能障碍[6]。AD 的发病机制学说包括淀粉样蛋白沉积假说、Tau 蛋白异常磷酸化假说、神经炎症假说、胆碱能损伤假说等[2]。研究认为,Aβ 大量沉积引起的小胶质细胞过度活化,诱发神经炎症反应是 AD 发病的关键病理机制之一,因此抑制小胶质细胞过度激活可减轻炎症反应的发生,从而降低神经元损伤[7]。TREM2在中枢神经系统中主要表达于小胶质细胞,促进小胶质细胞吞噬Aβ,减轻炎症反应、清除凋亡细胞等生物学活性[8]。SY是中药红花水溶性提取物的有效成分,具有抗炎、抗氧化和神经保护作用[9]。SY对APP/PS1小鼠具有改善认知功能的作用,但其如何调控TREM2 表达的相关机制还尚未明确,因此我们通过建立TREM2沉默的APP/PS1小鼠模型,探究TREM2在SY调节小胶质细胞活化程度,改善痴呆小鼠学习记忆功能中的作用。

AD模型小鼠外在表现形式为学习记忆能力的改变。实验结果显示,与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠空间学习记忆能力明显下降,经SY治疗后小鼠空间学习记忆能力明显提高。跳台与避暗实验则侧重于被动回避条件反射,Tg+LV组小鼠的潜伏期较Tg组小鼠明显缩短而且错误次数明显增多,SY给药后小鼠的潜伏期明显延长,错误次数显著减少,表明TREM2沉默后可以使小鼠的非空间记忆能力下降,SY则可以升高小鼠的非空间记忆能力。结果表明,TREM2沉默后小鼠学习记忆能力下降,SY可以改善TREM2沉默的APP/PS1小鼠学习记忆能力。

AD发病机制复杂,涉及多个病理环节。Aβ的异常沉积被认为是AD重要发病机制之一[10]。当脑内的Aβ生成过多,不能及时被清除,就会在神经细胞外大量聚集形成淀粉样斑块,引起神经元病变、神经元丢失等一系列病理变化[11]。结果显示,与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠脑组织中Aβ 阳性表达显著增多,SY给药后可使 TREM2沉默组小鼠脑组织中Aβ沉积减少。结果表明,TREM2的缺乏能够加剧Aβ沉积,SY对TREM2沉默的APP/PS1小鼠皮层和海马中Aβ沉积具有缓解改善作用。

Aβ是 AD 神经炎症反应的重要触发因素。当 Aβ 大量沉积时可诱导胶质细胞过度激活,促进炎症因子大量释放,进一步诱发神经炎症的发生,对神经元产生毒性作用,继而加重 AD[12]。Iba-1 是小胶质细胞激活的标志物,可反映小胶质细胞的活化程度[13]。结果显示,与Tg组小鼠相比,Tg+LV组小鼠脑组织中Iba-1表达显著增多,皮层组织中IL-6、IFN-γ 的含量显著升高,IL-4、IL-10的含量降低。SY给药后可使 TREM2沉默组小鼠脑组织中Iba-1表达显著降低,明显降低皮层组织中IL-6、IFN-γ 的含量,升高IL-4、IL-10的含量。结果表明,TREM2缺乏时小胶质细胞会过度活化,增加了炎症因子的释放,SY能缓解小胶质细胞的过度激活,减轻AD的病理损伤程度,同时也能降低神经炎症因子表达水平。

AD动物模型中发现,Aβ 可以通过与小胶质细胞上的TLR4相结合从而激活 NF-κB 等相关的炎症信号通路[14]。TLR4是在小胶质细胞中表达的I 型跨膜受体,可以诱导小胶质细胞激活,在介导神经炎症的信号通路中起重要作用。NF-κB作为关键的转录因子,处于 TLRs 下游信号通路的连接处,是引起促炎介质表达的关键因素[15-16]。TREM2 是一种主要由中枢神经系统的小胶质细胞表达的先天性免疫膜受体,TREM2 在小胶质细胞介导的吞噬功能、中枢神经炎症反应中发挥重要作用,能够提高小胶质细胞的吞噬能力,显著降低脑内促炎介质的表达,抑制神经炎症反应[17]。TREM2 是TLR4 信号通路的一种负性调节因子[18],可以调节TLR4及下游信号通路,减轻神经损伤,从而改善小鼠的认知功能。为验证SY是否通过调控TLR4/NF-κB通路抑制Aβ 沉积、小胶质细胞活化和炎症反应。本实验测定了TLR4、p-NF-κB/NF-κB 的蛋白表达,发现Tg+LV组TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平升高;经SY治疗后TLR4、p-NF-κB/NF-κB表达水平降低。结果表明,TREM2缺乏时TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平升高,SY可以通过调控TLR4/NF-κB 通路而抑制小胶质细胞的过度激活,进而发挥抑制神经炎症的作用。

综上所述,本研究发现SY可以改善TREM2沉默的APP/PS1小鼠学习记忆能力,减少脑内 Aβ 沉积,从而抑制脑内小胶质细胞的过度激活,降低炎症因子IL-6、IFN-γ 的表达水平,升高抗炎因子IL-4、IL-10的表达水平,抑制TLR4/NF-κB神经炎症通路的激活,从而发挥对神经元的保护作用。