绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定

袁利明,陈云蕾,刘素平,丁林玲,吴兰,赛务加甫*

(1 石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832000;2 西北农林科技大学,陕西 杨凌 712100;3 桐庐无规定马属动物疫病区管理中心,浙江 杭州 310000)

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PLC)是与大多数细胞受体激活相关的常见信号成分[1]。PLC-γ1作为PLC的一个亚型,可将磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP2) 转化为肌醇1,4,5-三磷酸 (IP3) 和甘油二酯 (DAG),由于DAG和IP3各自控制不同的细胞过程,也是合成其他重要信号分子的底物[2];在细胞增殖与分化[3]、细胞运动[4]、受精过程中的精卵识别[5]、淋巴细胞的活化肿瘤侵袭和转移[6]和机体生长发育等生命过程中发挥重要作用[7]。PLC-γ1在PLC中是独特的,是由受体酪氨酸激酶(RTK)磷酸化直接激活并在PLC-γ1的 Tyr 783位点上磷酸化,这种磷酸化是刺激磷脂酶活性的典型条件[8]。Hajicek等人[9]构建的磷酸化诱导PLC-γ1活化的模型显示,PLC-γ1的nSH2结构域介导自抑制酶向活化的受体酪氨酸激酶,以成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)的激活为例,如图1所示的募集引起PLC-γ1空间构型的改变,从而发脂肪酶的磷酸化依赖性激活。Ma等[10]通过敲除斑马鱼胚胎中的morpholino(MO)基因发现胚胎发育过程中PLC-γ1在细胞生成中具有重要调控作用。尽管初步研究表明PLC-γ1在早期胚胎发育具有重要作用,但涉及的分子机制鲜有报道。

2A肽(猪圆环病毒)是一类自剪切序列,称为“顺式作用元件水解酶”,含有18到22个氨基酸,在翻译到它的时候会断开,能够有效介导核糖体跳跃,通过自我切割实现上下游两个蛋白单独翻译[11-12];可以把同一条mRNA表达出的蛋白前后分开产生两个蛋白,用于构建多顺反子载体,实现同一个启动子控制下的两蛋白共翻译,形成非融合性蛋白[13-14]。同时,非融合性蛋白在结构和功能方面会基本一致,保持原有的免疫原性[15]。在构建载体同时,pDsRed2-C1载体上的DsRed2红色荧光蛋白为之后的转染提供了很好的依据,这为研究该基因的功能提供了更好的工具载体。

因此,本研究拟通过携带红色荧光蛋白(RFP)报告功能和2A肽的切割作用构建出活性更好的绵羊PLC-γ1非融合性真核表达载体,从而在不影响蛋白空间功能及活性基础上实现PLC-γ1蛋白表达,为后续研究绵羊PLC-γ1基因在绵羊早期胚胎发育分子机制研究上提供基础和便捷。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 载体与细胞

PUC57-PLC-γ1载体(本实验室已构建载体)、带有红色荧光蛋白的pDsRed2-C1载体、HEK-293T细胞,作者已构建好的PUC57-PLC-γ1载体,DH5α感受态细胞以上皆由动物疾病防控兵团重点实验室保存提供。

1.1.2 主要试剂和设备

质粒小提取试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、胶回收试剂盒、Marker II、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;增强型ECL 化学发光检测试剂盒(即用型)购置诺唯赞生物科技股份有限公司;Blue Plus® IV Protein Marker (10-180 kDa)购置于北京全式金生物科技有限公司;SDS-PAGE上样缓冲液、2×Taq MasterMix(Dye)购置于康为世纪生物科技有限公司;DL10000 DNA Marker、总提RNA试剂盒、反转录(Perfect Real Time)试剂盒、HindⅢ酶和SalⅠ酶均购置宝日医生物科技(北京)有限公司。细胞裂解液、PMSF、PBS、胰酶、DAPI、HRP标记二抗(羊抗兔)、FITC标记二抗(羊抗鼠)均购置北京索莱宝科技有限公司;QuantStudio 5实时荧光定量仪、Lip 2000、PageRuler? Prestained Protein Ladder(10-180 kDa)购置于赛默飞世尔科技公司;PLC-γ1一抗(羊抗兔)、β-actin一抗(羊抗兔)、Flag一抗(羊抗鼠)、SYBR染料、Flag磁珠、磁力架均购置于美国Bimake生物科技有限公司;犊牛血清、DMEM购置于BI公司。

1.2 方法

1.2.1 重组PLC-γ1序列的设计及合成

基于获取的绵羊PLC-γ1基因序列,在N端前加入P2A序列及3个连续Flag序列,两端分别加入HindⅢ和SalⅠ 酶切位点粘性末端。根据pDsRed2-C1载体图谱,在HindⅢ 酶切位点添加cg两个碱基,以保护蛋白正常翻译(表1)。将设计好的序列及含PUC57-PLC-γ1载体的菌液送至上海生工股份有限公司合成,并连接在PLC-γ1基因两端并纯化至PUC-57载体上。

表1 合成序列

1.2.2 重组pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1表达载体的构建

PUC57-P2A-3×Flag-PLC-γ1载体和pDsRed2-C1载体用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,按照胶回收试剂盒说明书进行胶回收并纯化。纯化后用T4连接酶将P2A-3×Flag-PLC-γ1片段与酶切后的pDsRed2-C1空载质粒连接,并转化到DH5α感受态细胞,涂布在卡那抗性的固体LB平板。16 h后挑单克隆菌株、摇菌并菌液PCR反应鉴定,以待检单克隆菌落为模版,以PUC57-P2A-3×Flag-PLC-γ1为引物。PCR扩增体系25 μL:待检单克隆菌落2 μL,2×Taq MasterMix(Dye)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 9.7 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,56 ℃退火30 s;72 ℃延伸 60 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min,引物如(表2)。将菌液PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将具有特异性条带的单克隆菌落保菌送至上海生工股份有限公司测序。

1.2.3 重组质粒转染HEK-293T细胞

将测序正确的pDsRed2-C1-PLC-γ1重组表达质粒和pDsRed2-C1空载质粒进行菌液活化培养,并用天根去内毒素大提质粒试剂盒进行大提质粒。用脂质体Lip 2000将重组质粒和空载质粒各4 μg、ddH2O 4 μL转染到HEK-293T细胞中,24 h后在体视荧光显微镜下观测转染情况并记录。

1.2.4 实时荧光定量检测HEK-293T细胞中PLC-γ1 mRNA的相对表达量

待转染24 h后用PBS洗涤,并加入500 μL Buffer RL吹打细胞转移至2 mL无酶离心管内,按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 说明书提取实验组pDsRed2-C1-PLC-γ1、pDsRed2-C1、ddH2O对照组细胞的总RNA。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒进行反转录,并去除基因组DNA。

根据绵羊β-actin 基因(登录号:443052)和绵羊P2A-3×Flag-PLC-γ1基因序列设计实时荧光定量qPCR引物(表3)。实时荧光定量qPCR反应体系为20 μL,反应体系:2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,cDNA 1 μL,PLC-γ1/β-actin-qPCR-F(10 μmol·L-1)0.8 μL,PLC-γ1/β-actin-qPCR-R(10 μmol·L-1)0.8 μL,50×ROX Reference Dye(low Donc)0.4 μL,ddH2O 7 μL;利用Quant StudioTMDesign &Analysis Software软件设计实时荧光定量qPCR反应程序试验采用相对定量反应程序为:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃ 1 min 45个循环,最后95 ℃变性15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃变性15 s以获得溶解曲线。每组样品均重复3次试验。

表3 实时荧光定量qPCR引物

1.2.5 Western blot鉴定3×Flag-PLC-γ1蛋白表达

将转染48 h后的3组细胞用PBS洗涤3遍,250 μL RIPA(含1 mmol·L-1PMSF)洗脱至1.5 mL离心管中,4 ℃冷却30 min,14 000 g离心5 min;按照索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒将3组蛋白浓度稀释统一浓度。取16 μL样品加入4 μL 5×Loading buffer蛋白上样,混匀后于金属浴100 ℃煮沸5 min,进行SDS-PAGE聚丙烯胺凝胶电泳。将样品转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h,PBST漂洗滤膜3次,每次10 min,以兔抗PLC-γ1单抗为一抗(1∶1 000倍稀释)4 ℃过夜孵育,然后 PBST 漂洗滤膜 3 次,每次10 min,以辣根过氧化物酶标记好的羊抗兔HRP-IgG为二抗(1∶10 000倍稀释)室温孵育2 h,再用 PBST 漂洗滤膜 3 次,每次10 min,按照说明书配制ECL发光液,点滴在PVDF膜上孵育2 min后在化学发光成像仪曝光拍照记录,按照HRP-DAB底物显色试剂盒说明书对PVDF膜染色,观察特异性条带并拍照记录。

1.2.6 Co-Immunoprecipitation纯化鉴定3×Flag-PLC-γ1蛋白

用移液枪轻柔吹打重悬Anti-Flag免疫磁珠,吸取20 μL磁珠悬液加入到1.5 mL的离心管中;加入500 μL TBS,轻柔吹打重悬的磁珠,于磁力架上静置10 s后去除上清液,重复上述步骤2次;在上述沉淀中加入200 μL pDsRed2-C1-PLC-γ1重组质粒转染的HEK-293T细胞蛋白,并轻柔吹打重悬磁珠,室温孵育2 h;磁力架上静置10 s后移除上清液,向沉淀中加入500 μL PBST并轻柔吹打重旋磁珠,然后上下翻转样品5 min。磁性分离后移除上清并回收检测非特异性蛋白,重复上述步骤两次;所得沉淀中加入50 μL 1×Loading buffer蛋白上样缓冲液并煮沸5 min,冷却至室温并在磁力架上静置10 s,取上清进行SDS-PAGE检测。

1.2.7 PLC-γ1蛋白的细胞亚定位

HEK-293T细胞转染前,将细胞爬片置于六孔板中,转染按照1.2.4试验方法操作。转染48 h后用1×PBS震荡洗涤3遍,每次5 min(后面每一步前都按照如此操作)。固定:4%多聚甲醛,室温浸泡20 min;透膜:0.1 %放入Trition-100透化10 min(可在镜下观察到细胞膜打孔的现象);封闭:加入5 % BSA,室温下封闭1 h;孵育鼠抗Flag-tag一抗(1∶300 倍稀释):不需要清洗直接加入一抗50 μL,4 ℃孵育过夜;孵育偶联荧光素FITC二抗(1∶500倍稀释):加入二抗500 μL,37 ℃孵育40 min(避光);染核:DAPI染色10 min(避光);封片:50%甘油取5 μL涂布在载玻片上,小心气泡(避光),用弯曲的镊子取出细胞爬片,将有细胞的一面朝覆盖到载玻片上,在激光共聚焦显微镜下观察分析并拍照。

1.3 数据分析

1.3.1 实时荧光定量数据处理分析

Quant Studio 5实时荧光定量仪反应后,将数据导入Quant StudioTMDesign &Analysis Software软件中,进行溶解曲线分析检测产物特异性,确定其获得产物为目的产物。对PLC-γ1和β-actin基因的溶解曲线具有单峰特异性产物进行PLC-γ1基因的定量分析,并将数据导出Excel中,采用2-ΔΔCT法计算,其中ΔCT=目的基因CT-内参基因CT,ΔΔCT=实验组ΔCT-对照组ΔCT。得到数据用SPSS 21进行单因素方差分析中LSD检验进行两两比较分析,P<0.05为差异性显著,数据分析后用Origin作图。

1.3.2 Images J 分析PLC-γ1蛋白相对表达分析

将ECL曝光图像导入Images J 软件,对PLC-γ1条带和β-actin条带进行灰度值计算,重复3次并计算均值,PLC-γ1条带灰度值与其相应内参β-actin比值为相对灰度值,可表示为该基因相对表达。将对照组ddH2O组相对灰度值设置为1,其他组按照相应比值进行调整并用SPSS 21软件分析差异性,Origin软件绘制柱状图。

2 结果

2.1 重组pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1表达载体的构建

将原有为大小3 886 bp的PLC-γ1基因N端合成添加P2A-3×Flag序列,由上海生工股份有限公司重组构建为大小4 022 bp的P2A-3×Flag-PLC-γ1序列,将含该基因的PUC57菌液活化,经质粒提取,HindⅢ和SalⅠ双酶切后电泳鉴定结果如图2,符合预期大小。胶回收后连接到pDsRed2-C1真核表达,转化后挑单克隆菌株,经2%琼脂糖电泳菌液PCR鉴定结果如图3显示,将阳性菌送至上海生工测序,测序结果成功构建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1(pDsRed2-C1-PLC-γ1)重组真核表达载体,载体图谱如图4显示。

M:DL10000 DNA Marker;N,PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1质粒;1:PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1质粒双酶切。图2 PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1质粒双酶切鉴定

M:Marker II;1、2、4,阳性;3、5,阴性。图3 菌液PCR鉴定

图4 重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1示意图

2.2 重组质粒pDsRed2-C1-PLC-γ1转染HEK-293T细胞

复苏HEK-293T细胞后,在细胞对数生长期内将实验组重组质粒pDsRed2-C1-PLC-γ1、空载质粒pDsRed2-C1、对照组ddH2O,通过脂质体Lip 2000转染到HEK-293T细胞内。转染24 h后在荧光倒置显微镜下经绿色荧光激发,结果如图5显示,转染重组质粒和空载质粒组均可观察到红色荧光表达,对照组无红色荧光表达,说明重组质粒成功转染到HEK-293T细胞内并表达。

图5 重组质粒转染HEK-293T细胞 200×

2.3 实时荧光定量检测PLC-γ1的mRNA相对表达量

待转染24 h后,收集HEK-293T细胞提取总RNA,反转录成cDNA为模板,β-actin为内参。通过实时荧光定量PCR检测细胞中PLC-γ1的表达量,结果显示重组质粒Pdsred2-C1-PLC-γ1组表达量极显著高于其他两组(P<0.01),其中空转载体与空白对照组表达量无明显差异,如图6所示。

图6 重组质粒转染HEK-293T细胞的mRNA水平表达量(**P<0.01)

2.4 Co-Immunoprecipitation鉴定纯化3×Flag-PLC-γ1蛋白

对转染48 h重组pDsRed2-C1-PLC-γ1质粒的HEK-293T细胞裂解,用Flag标签标记的免疫磁珠进行免疫共沉淀反应,来纯化3×Flag-PLC-γ1蛋白。经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果如图7显示,蛋白在158 kDa处呈现特异性单一蛋白,IP上清回收液和HEK-293T细胞蛋白均有蛋白杂带,表示构建含Flag标签的PLC-γ1质粒成功构建并表达。

M. 蛋白 Marker;1:纯化的3×Flag-PLC-γ1蛋白;2:IP上清回收液;3:HEK-293T细胞蛋白。图7 IP鉴定携带Flag标签的PLC-γ1蛋白

2.5 Western blot鉴定PLC-γ1蛋白表达

转染HEK-293T细胞48 h后,对转染重组pDsRed2-C1-PLC-γ1质粒、空载pDsRed2-C1质粒的实验组细胞和对照组转染ddH2O的细胞裂解,经ECL化学发光成像仪曝光,结果如图8显示,转染重组质粒pDsRed2-C1-PLC-γ1的条带尤为明显,用Image J软件成像分析计算三组蛋白相对表达量,SPSS 21检验差异性,结果图9显示,转染重组质粒的PLC-γ1蛋白表达量与其他两组有极显著区别。

图9 重组质粒转染HEK-293T细胞的蛋白水平表达量(**P<0.01)

2.6 PLC-γ1蛋白的细胞亚定位

转染HEK-293T细胞48 h后,对转染pDsRed2-C1-PLC-γ1重组质粒的试验组、pDsRed2-C1质粒的对照组细胞用PBS清洗并用5 %BSA封闭。经抗Flag一抗孵育和荧光素标记的二抗孵育并DIPA染核后,在激光共聚焦显微镜下,结果如图10显示,转染pDsRed2-C1质粒的对照组可观察到红色荧光DsRed2蛋白表达,蛋白主要表达在细胞质中,但在红色荧光同一细胞下无法观察到FITC标记的绿色荧光PLC-γ1蛋白。转染pDsRed2-C1-PLC-γ1重组质粒的试验组均可观察到FITC标记的绿色荧光和红色荧光DsRed2的蛋白表达,可间接证明PLC-γ1成功表达,并表达在细胞质中。

图10 激光共聚焦显微镜检测PLC-γ1蛋白在HEK-293T细胞的亚定位

3 讨论

受体酪氨酸激酶(RTK)是由一个大的细胞外配体结合区、一个跨膜结构域和一个细胞内催化激酶结构域组成,RTK可与表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等生长因子识别并结合,其中像配体PLC-γ1的结合通常诱导RTK上的单体二聚,触发C末端酪氨酸残基的反式自磷酸化,使这些残基可以作为PLC-γ1等酶的补充位点[16]。由于RTK的内在激酶活性,使这些与之相适配的蛋白磷酸化,从而增加单个受体激活后的信号通路并使其多样化[17]。在功能方面上,RTK介导的信号转导机制主要通过细胞外信号调节激酶ERK 1/2、粘着斑激酶(FAK)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶B(Akt)介导,从而促进细胞增殖、迁移和存活[18-19]。这些研究说明PLC-γ1在RTK介导的信号转导机制中扮演重要的角色。尽管在Ma ACH研究中已证实PLC-γ1在早期胚胎发育具有重要作用,但只是在小鼠等模式动物基因敲除的研究,并且涉及的分子机制仍不清楚。

因此,本研究在原有PUC57-PLC-γ1载体基础上,构建具有DsRed2红色蛋白作为示踪标记的pDsRed2-C1载体作为过表达真核载体,进一步探索上调水平下PLC-γ1在早期胚胎发育具体作用机制。pDsRed2-C1载体不仅对宿主细胞不具有毒性,且不会影响目的蛋白的表达,可以直接在荧光显微镜下观察到融合蛋白表达和定位情况,故在融合蛋白真核表达研究中具有不可替代的作用。然而,pDsRed2-C1载体的DsRed2红色蛋白大小为55.48 kDa,而MCS位点位于DsRed2红色蛋白之后,使之与目的蛋白形成融合蛋白来表达。在常用的2A肽中的P2A与T2A可以使红色荧光蛋白(RFP)表达提高1.47倍,并且P2A 可以有效地驱动转基因在细胞中的表达[11]。综上所述,为了不影响其目的蛋白PLC-γ1的空间结构及功能,在构建真核表达载体时,我们选用具有高效切割作用的P2A肽来连接DsRed2红色蛋白和PLC-γ1目的蛋白。相关研究发现在目的基因上衔接一段Flag标签的真核表达载体可使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)技术更方便的探究上下游信号通路相关蛋白表达及联系[20-21]。为了更好地研究PLC-γ1在RTK信号通路的作用机制,便在PLC-γ1目的基因N端添加了3×Flag标签成功构建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1质粒。结果显示重组质粒在HEK-293T细胞中转染后成功表达PLC-γ1蛋白,且与DsRed2红色蛋白分割成功。通过mRNA和蛋白水平鉴定发现处于对数生长期的HEK-293T细胞也能表达PLC-γ1蛋白,与重组质粒差异极显著(P<0.01),其中PLC-γ1在mRNA水平上表达与对照组比较差异极显著(P<0.01),这可能与基因的转录及翻译调节有关,具体机制有待进一步研究。在免疫共沉淀上,我们运用Flag标签的免疫磁珠成功分离出含3×Flag标签的PLC-γ1蛋白,蛋白大小为158 kDa,表示该3×Flag标签成功构建到目的蛋白上,且在传统的提纯真核细胞的蛋白质上,Bimake公司的免疫磁珠在提取蛋白上更具操作简单、省时、特异性高等优势。在亚细胞定位中我们运用免疫荧光技术,通过使用抗Flag标签的特异性一抗及FITC荧光素标记的二抗来定位PLC-γ1蛋白,结果显示DsRed2红色蛋和PLC-γ1蛋白均分布在细胞质中,同时,也进一步验证了3×Flag标签的表达。

4 结论

本研究成功构建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1真核表达载体,证实其在P2A肽作用下,目的蛋白PLC-γ1与DsRed2红色荧光蛋白成功分割,且不影响PLC-γ1蛋白的功能和空间结构。为后续研究绵羊PLC-γ1基因通过RTK信号通路调控绵羊早期胚胎发育分子机制研究上提供基础和便捷。