北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

孙丹岚，买占海，佟盼盼，陈见兴，罗 洁，张 磊，布阿依夏木·吾斯曼，况 玲

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

链球菌种类繁多，有的属于动物正常菌群，而有的是致病菌，如化脓性链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌等，可引起动物的肺炎、败血症、脑膜炎、乳腺炎等，给畜牧养殖业和公共卫生造成严重威胁。肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,SP）发现于1881年，是各种感染如社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、脓肿、败血症等的主要致病菌之一，尤其对于婴幼儿和老年人，其中肺炎、败血症和脑膜炎致死率较高[1]。SP有超过90种血清型，且目前的疫苗不能完全覆盖[2-3]。SP携带多种毒力基因，其导致各种感染疾病的具体机制有待明确，毒力基因在此过程中可能具有重要作用，这种作用可能体现在毒力基因的有无和表达水平两个方面[4-6]。

马链球菌（Streptococcusequi,S.equi）属于兰氏分群的C群β溶血链球菌，包括兽疫亚种（Streptococcusequisubspecieszooepidemicus,SEZ）、马亚种（Streptococcusequisubspeciesequi,SEE）和类马亚种（Streptococcusequisubspecies ruminatorum,SER）三个不同的亚种[7]。马腺疫（Strangles）是一种散发性或地方流行性的马属动物接触性传染病，该病以发热、上呼吸道黏膜炎症、颌下淋巴结肿胀化脓为典型特征[8]。带菌马已被认为是维持病原体长期存在和暴发感染的重要因素[9]。其发病率可达100%，死亡率达10%[10]。病菌随病马喷鼻、咳嗽及脓肿破溃排出体外，经消化道、上呼吸道黏膜、扁桃体或受损皮肤感染健康马匹[11]。患病幼驹也可因吮乳，将细菌传染给母马，引起马乳房炎，甚至引发败血症[12]。

马链球菌的致病性和耐药性研究在国内研究较少，常见的毒力基因有fneB[13]，临床常用青霉素、四环素和磺胺类药物等进行治疗[14]，同时，耐药链球菌的出现也导致基层马场遭受很大经济损失，临床用药亟需新的思路。本实验通过对马场采集样品进行细菌分离培养，利用药敏实验和PCR检测，测定并分析马链球菌及其他链球菌的耐药性和毒力基因，从而为基层马场临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种来源 24株链球菌分离自2019年9月至2020年4月昌吉及伊犁马场的132份健康及患病马匹马鼻拭子样本。

1.2 主要试剂 THB培养基购自青岛高科技工业医海博生物技术有限公司；革兰氏染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司；药敏纸片：青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、恩诺沙星、磺胺甲基异恶唑购自杭州滨和生物公司。

1.3 细菌分离培养与纯化 无菌状态下吸取采集的马鼻拭子样品1 mL加入到3 mL THB液体培养基中，在37℃、160 rpm的摇床中震荡培养12～24 h，进行增菌培养。用接种环沾取菌液在THB固体培养基上进行平板划线接种，倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养，观察菌落形态，挑取针尖大小的菌落继续培养。一般需要提纯3次或3次以上，直到培养基菌落单一、稳定为止。

1.4 菌株的形态观察 显微镜观察挑取纯化的单菌落进行革兰氏染色，在油镜（100×）下观察其形态特征。

1.5 菌株的PCR鉴定及测序 以提取的分离菌株基因组DNA为模板，用16S RNA通用引物，进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）为：上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，2×TaqPCR Green Mix 25 μL，ddH2O补至50 μL。用凝胶成像分析系统观察结果。扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。目标条带大小为197 bp。将鉴定有目标条带的PCR产物测序。

1.6 药敏实验 采用标准K-B纸片扩散法，检测分离菌株对青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、恩诺沙星、磺胺甲基异恶唑12种抗生素的敏感性。

1.7 菌株耐药基因及毒力基因的检测 通过PCR和琼脂糖凝胶电泳分析从链球菌中提取的DNA，确定是否存在耐药基因或毒力基因。根据相关文献报道和现有研究，选取流行率较高的基因[15-17]。耐药基因分别为：耐β-内酰胺类（blaTEM、blaCTX-M）、耐四环素类（tetA）、耐磺胺类（SulI）、耐喹诺酮类（qnrA、aac(6')）。以上6个耐药基因PCR扩增引物序列和反应运行参数见表2。毒力基因分别为：ply、pspA、nanA、psaA、lytA、seM、fneB。以上7个毒力基因PCR扩增引物序列和反应运行参数见表2。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系（20 μL）为：2×TaqPCR Green Mix 10 μL，上、下游引物1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补至20 μL。用凝胶成像分析系统观察结果，胶回收产物于-20℃保存备用。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

表2 链球菌对常见菌药敏实验结果Table 2 Results of drug sensitivity test of Streptococcus to common bacteria

2 结果

2.1 培养结果 链球菌在THB固体培养基平板上培养，直径0.1～1.0 mm，灰白色，表面光滑，边缘整齐的小菌落。马链球菌在绵羊血平板上长出针尖大小白色菌落，有溶血环（图1）。

图1 马链球菌马亚种在绵羊血培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of Equi on sheep blood

2.2 镜检结果 菌体呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，直径0.6～1.0 μm。菌体似矛头状排列单个或多个排列成链状，无芽孢、无菌毛（图2）。

图2 链球菌革兰氏染色镜检结果（100×）Fig.2 Microscopic examination of Streptococcus by Gram staining (100×)

2.3 PCR结果 根据目的条带显示，对采集样品进行PCR鉴定，共得到24株链球菌。图3为其中两株菌的结果。

图3 链球菌16S PCR扩增结果Fig.3 Amplification results of Streptococcus 16S PCR

2.4 测序结果 对在197 bp目的条带下的11株菌进行测序，通过测序确定9株马链球菌马亚种（Y1、Y2、Y3、D1、D2、D3、L1、L2、L3），两株肺炎链球菌（0-1，35-61）。

2.5 药敏结果 24株链球菌对12种抗菌药物的耐药情况由表2和表3可见，本实验所分离的肺炎链球菌对强力霉素、青霉素的耐药率很高，对四环素、头孢他啶的耐药率也较高，对磺胺甲基异恶唑、恩诺沙星、氨苄西林、氯霉素都较为敏感。所分离的马链球菌对磺胺甲基异恶唑耐药性较高，对氨苄西林、头孢噻肟、四环素的耐药性也超过半数，对氯霉素、头孢氨苄、头孢他啶、庆大霉素、强力霉素的耐药性较低，对红霉素、恩诺沙星敏感。

表3 马链球菌对常见菌药敏实验结果Table 3 Drug sensitivity test results of Streptococcus equi to common bacteria

2.6 耐药基因检测结果 对鉴定出的24株链球菌分离株进行6种耐药基因检测，检测结果如表4所示，除blaCTX-M、tetA、SulI和aac(6')基因外，其余2种耐药基因均有检测到。其中blaTEM基因在17个菌株中均被检出，对各菌株耐药基因组合分布进行统计，含有2个以上耐药基因的菌株有2株（8.3%），其余7株菌未检测出任何耐药基因（表4）。部分阳性结果见图4、图5。

图5 qnrA基因检测结果Fig.5 qnrA gene detection results

表4 不同菌株的耐药基因检测情况Table 4 Detection of drug resistance genes

2.7 毒力基因检测结果 对鉴定出的24株链球菌分离株进行7种毒力基因检测，检测结果可知，除pspA、nanA、psaA和seM基因外，其余3种毒力基因均有检测到。其中lytA和fneB基因分别在8个和9个菌株中均被检出，对各菌株毒力基因组合分布进行统计，含有3个以上毒力基因的菌株有3株（12.5%），其余10株菌未携带毒力基因（表5）。部分阳性结果见图6～8。

图6 ply基因检测结果Fig.6 ply gene detection results

图7 lytA基因检测结果Fig.7 lytA gene detection results

图8 fneB基因检测结果Fig.8 fneB gene detection results

表5 不同菌株的毒力基因检测情况Table 5 Detection of virulence genes

3 讨论

马亚种马链球菌是马腺疫的主要病原，在马和驴的脓肿淋巴结中也曾分离出，马链球菌的致病性耐药性研究在国内研究较少，本研究分离出的链球菌中，有9株马链球菌，其中D1、D2、D3、L1、L2、L3 6株马链球菌来自昌吉某马场，Y1、Y2、Y3 3株菌来自伊犁某马场，Neamat-Allah等[17]认为马腺疫全年发病，但在春季发病率较高，Radostits等[18]研究得出马腺疫多发生于寒冷季节的结论，本研究的样品为秋季和春季末采集。

本实验分离出的肺炎链球菌和马链球菌马亚种，样品均采样自昌吉某马场。分离出的马链球菌马亚种中有1株对庆大霉素、氯霉素耐药；有5株对四环素耐药；有5株对头孢噻肟耐药；有1株对头孢他啶耐药；有4株对氨苄西林耐药。

根据耐药基因的结果，24株菌株中，有17株携带β-内酰胺类耐药基因blaTEM，说明在链球菌中blaTEM基因有较高携带几率，其中1株链球菌（HW5-1-2）和1株马链球菌（Y1）同时携带了喹诺酮类耐药基因qnrA，为多重耐药菌株。经过耐药表型和耐药基因数据的对照可知，耐药表型与耐药基因并不完全相符，如马链球菌和其他链球菌对四环素类药物的耐药率均较高，马链球菌5株，其他链球菌10株，但因为只检测了一种四环素类耐药基因（tetA），并没有检测出相关耐药基因的存在，可能是菌株DNA中还有没发现的其他耐药基因存在，本次实验没有检测到。根据毒力基因的结果来看，有5株链球菌携带lytA基因，9株马链球菌均携带fneB基因，值得关注的是，有3株马链球菌同时携带3个毒力基因，分别为ply基因，lytA基因及FneB基因。根据耐药性结果和毒力基因结果综合分析，马链球菌（Y1），同时携带两种耐药基因（blaTEM基因和qnrA基因）及一种毒力基因（fneB基因）。在临床用药中应尽量避免在对马链球菌引起的疾病中用β-内酰胺类药物进行治疗。

通过本次实验可知，北疆地区马源链球菌对常见药物有较高的耐药率，提示该地区耐药情况比较严重；应重视由耐药菌株引起的链球菌病在马场中传播的严峻形势。综上所述，应做到抗生素轮换使用并谨慎选择，避免因滥用抗生素出现大量耐药菌。