湖北省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

朱玲玲，孙敏华，胡 怡，汪 婷，徐 欢，汪 威，殷世彬，汪招雄

（1.长江大学动物科学学院，荆州 434025；2.广东省农业科学院兽医研究所，广州 510640）

鸭传染性浆膜炎（infectious serositis of duck）是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer,RA）感染鸭引起的一种高度接触性败血性传染病[1-2]。该病多见于1～8周龄雏鸭，发病率和死亡率都非常高，其特征症状为肝周炎、纤维素性心包炎、脑膜炎和气囊炎，是当前严重危害养鸭业的细菌性传染病之一，每年给我国养鸭业造成严重的经济损失[3-4]。在生产实践中由于抗生素的长期大量使用，越来越多的RA表现出耐药性，其耐药谱广泛且不同的菌株耐药性存在极大的差异[5]。目前已对RA检测到氯霉素、氟苯尼考、红霉素等抗生素的耐药基因，耐药株的广泛出现，严重影响了抗生素防治该病的临床效果[6-7]。

本试验从湖北不同地区规模化鸭场采集了鸭传染性浆膜炎疑似病例肝脏，分离鉴定了34株RA菌株，并对菌株进行了耐药谱分析，测定了氟苯尼考flor基因，为今后湖北省RA的药物防控提供了近期的实验数据，为flor耐药性机制的研究奠定了良好基础。

1 材料和方法

1.1 病料和主要试剂 从湖北荆州、潜江、荆门等地多个患病鸭场采集疑似鸭传染性浆膜炎肝脏，病鸭均表现神经症状，解剖可见典型的纤维性心包膜炎、肝周炎等病理变化。胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）和胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）均购自美国BD Bifco公司；药敏片购自中国药物研究所。

1.2 引物的设计与合成 根据RAOmpA基因序列设计特异性检测引物，RA-OmpA-F为ATGTTG ATGACTGGACTTGGT，RA-OmpA-R为CTTCAC TACTGGAAGGTCAGA，扩增片段长度为1119 bp；根据RAflor基因序列设计特异性检测引物，上游引物flor-F为ATGACCACCACACGC，下游引物为RAOmpA-R为TTAGACGACTGGCGACT，扩增片段长度为1215 bp。引物序列均由华大基因有限公司合成。

1.3 细菌的分离 无菌采集鸭传染性浆膜炎疑似病例肝脏，在TSA培养基上划线接种，37℃培养24～48 h，挑取单菌落于TSB中，37℃振荡培养16～40 h。

1.4 细菌革兰氏染色 挑取纯化过的单菌落，涂抹于干净的载玻片，用细菌革兰氏染色法进行染色，在油镜下观察其形态特征。

1.5 生化试验 对分离细菌进行葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露醇和山梨醇，靛基质、VP试验、硝酸盐还原、硫化氢产生、甲基红、触酶、氧化酶等试验。

1.6 RA的PCR鉴定 取50 μL菌液在沸水中煮5 min作为模板备用，构建20 μL PCR反应体系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反应条件：94℃预变性8 min；94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃终延伸1 min。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像下观察。

1.7 药敏试验 取200 μL菌液均匀涂布于TSA平板上，待菌液吸收后，在平皿上均匀贴上药敏纸片，37℃培养16 h，测量、记录结果。

1.8 RA氟苯尼考耐药基因PCR鉴定 取50 μL菌液在沸水中煮5 min作为模板备用，构建20 μL PCR反应体系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反应条件：94℃预变性8 min；94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃终延伸1 min。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像下观察。

2 结果

2.1 鸭疫里默氏杆菌培养特性 分离的菌株在普通培养基和麦康凯培养基上不能生长，TSA培养基上生长旺盛，菌落为白色圆形，大小1～2 mm，表面光滑。在含有胰蛋白酵母的肉汤中37℃培养48 h后，培养基中呈现轻微浑浊现象，管底出现少量沉淀。

2.2 形态及染色 革兰氏染色可见分离菌株呈现典型的两极着色红色短小杆菌。多数单个存在，少数成双或短链排列（图1）。

图1 RA革兰氏染色形态特征Fig.1 Morphological characteristics of RA

图2 RA OmpA基因 PCR检测结果Fig.2 The detection of RA OmpA gene by PCR

图3 RA氟苯尼考flor基因PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification of flor gene in RA

2.3 分离菌株的生化鉴定 对分离菌株进行生化试验，结果表明34株分离菌株不发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇。枸橼酸盐、甲基红试验、VP试验均为阴性，氧化酶、尿素反应为阳性。

2.4 分离菌株特异性PCR鉴定 34株菌株PCR扩增产物菌呈现特异性条带，大小与目的基因片段一致。将PCR胶回收产物送至擎科生物科技有限公司测序，测序结果经NCBI数据库比对，与RA的OmpA基因序列同源性高达99%。

2.5 RA耐药性分析 药敏试验显示，34株分离株耐药性较强，对头孢噻肟、大观霉素和阿米卡星敏感性比较高，对新霉素和诺氟沙星耐药性最强，对氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、多西环素的耐药性介于二者之间。

表1 34株鸭疫里默氏杆菌对12种抗生素耐药性分析Table 1 Drug resistance of 34 strains of Riemerella anatipestifer to 12 antibiotics

2.6 RA氟苯尼考flor基因的PCR鉴定及序列分析 对34株RA进行氟苯尼考耐药基因flor、fexA、fexAv、fexB、cfr进行PCR测定，结果只有flor基因显示目的条带，其他基因均不显示。其中16株RA扩增出与目的片段大小一致的特异性片段，胶回收产物送至擎生物科技有限公司测序，所得序列与flor全基因序列比对，相似性高达100%。

3 讨论

本研究从湖北省鸭场采集了鸭传染性浆膜炎疑似感染鸭病料，分离和鉴定了34株鸭疫里默氏杆菌。药物敏感性试验表明，34株分离株耐药性普遍较强，耐药谱较广，很多分离的菌株对3种以上的抗生素产生了耐性性。对12种抗生素耐药性比较分析显示，头孢噻肟、大观霉素和阿米卡星对大部分分离菌株比较敏感，但是分离菌株对新霉素和诺氟沙星耐药性最强，超过三分之二的菌株产生了耐药性，对氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、多西环素的耐药性介于两者之间。对耐药性统计表明在临床上用于治疗RA的常规药物品种有限，有些药物在较低的浓度下基本上失去作用，预示着加大了临床药物防治该病的难度，穿梭用药、联合用药以及使用高成本药物势必会增加养殖成本，将进一步提高RA对少数品种药物耐药性的风险[8-11]。

氯霉素类药物具有抗菌谱广、吸收快的特点，广泛分布于体内，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都是该类药物里的经典药物等。氟苯尼考价格低廉，近些年在鸭场被广泛用来防控RA，近年来分离出来的具有氟苯尼考抗性的RA比例逐渐增加，呈现越来越广泛的趋势[12-13]。本研究在药物敏感试验的基础上，对34株分离株测定了氟苯尼考flor基因，发现其中16株分离株携带该基因，进一步验证了RA对氟苯尼考耐药的广泛性和严重性。