高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株作为外源基因表达活病毒载体的研究

陈金霞，张 宽，张玉娇，杜楠楠，郑海红，李丽薇,2，周艳君,2，虞凌雪,2，童 武,2，郑 浩,2，童光志,2，高 飞,2

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.扬州大学 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS），俗称为“蓝耳病”，是一种能够引起母猪繁殖功能和仔猪呼吸功能障碍的严重接触性传染病。自1996年在我国暴发后，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。该病病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，同属病毒还有马动脉炎病毒（Equine arteritis virus,EAV）。PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约15 kb，具有5'帽状结构和3' poly（A）尾结构，基因组两端具有5'非翻译区（5'-untranslated region，5'UTR）和3'非翻译区（3'-untranslated region，3'UTR）[1-2]。同大多数的套式病毒一样，基因组以非连续性转录的方式合成亚基因组（subgenomic mRNA,sg mRNA）[3-4]，翻译出结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5a、GP5、GPM和N[1-2]。在非连续性转录机制中，基因组中的转录调控序列（transcription-regulating sequences,TRS）发挥重要的作用，据研究证明，在合成负链的body TRS的时候，其与基因组上的正链leader TRS相结合，如同接受到一个信号，发生Leader-Body junction[5]。负链的body TRS转而去结合正链的leader TRS，然后继续延伸负链的leader序列，这就产生了负链的亚基因组mRNA。再以负链亚基因组mRNA为模板，产生一系列正链的亚基因组mRNA，用以翻译结构蛋白[6-7]。在此过程中，负链的body TRS和正链的leader TRS的一级核心寡核苷酸序列的碱基互补配对至关重要。有研究证明，PRRSV的ORF1b和ORF2之间，是非常有效的外源基因插入位点，在该位点，将CSFV囊膜蛋白（E2）蛋白的编码基因以及转录调控序列TRS6 cassette插入该位点，经过鉴定验证，该重组突变病毒能够正常表达PRRSV核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）和CSFV E2蛋白并稳定遗传[8]。在此基础上，该研究，基于rPRRSV-E2的感染性克隆，在ORF7与3'UTR之间插入表达绿色荧光蛋白的编码基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP），并对拯救出的重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP进行验证，为开发PRRSV作为活载体疫苗提供了一个新的构建策略和新的插入位点，并为今后研发多价疫苗奠定了研究基础。

1 材料和方法

1.1 细胞与病毒 非洲绿猴肾细胞（MARC-145）和乳仓鼠肾细胞（BHK-21）由本实验室保存。高致病性猪繁殖与呼吸综合征HuN4细胞传代致弱株pHuN4-F112，表达猪瘟病毒E2蛋白的重组PRRSV：rPRRSV-E2的全长感染性克隆prPRRSV-E2由本实验室构建和保存。

1.2 试剂 限制性内切酶购自NEB公司；TOP10感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司公司；化学转染试剂DMRIE-C试剂、突变PCR用高保真聚合酶为pfuⅡDNA Polymerase、OPTI-MEM、荧光二抗Alexa Fluor 488/568-labeled goat anti-mouse IgG（H+L）购自Agilent公司；PRRSV的N蛋白的单克隆抗体由本实验室保存；CSFV E2蛋白的单克隆抗体由本实验室制备。

1.3 重组质粒构建 在prPRRSV-E2全长感染性克隆的基础上，通过SOE-PCR的方法，利用MluⅠ和SwaⅠ限制性酶切位点在ORF7和3'UTR之间插入由TRS6 cassette引导的EGFP基因，构建rPRRSV-E2-EGFP重组全长感染性克隆质粒pA-E2-EGFP。利用QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取突变体质粒。本文中所用到的引物见表1，构建方法示意图见图1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Oligonucleotides of primers used in this study

图1 重组突变全长克隆pA-E2-EGFP的构建示意图Fig.1 Schematic representative for the construction of the full-length cDNA clone pA-E2-EGFP with recombinant mutant

1.4 病毒拯救和传代 利用SwaⅠ酶将全长突变质粒线性化（图2C），然后用QIAquick PCR Purification试剂盒纯化回收线性化的全长感染性克隆。以纯化后的线性化质粒为模板，进行体外转录得到pA-E2-EGFP的RNA（图2D），以等量的转染试剂DMRIE-C混合大约1 mL OPTI-MEM转染至细胞密度大概为60%的BHK-21细胞，转染72 h后传代于细胞密度80%的MARC-145细胞[9]，在5% CO2、37℃培养箱中培养，每天观察细胞病变（cytopathic effect,CPE），直至观察到细胞病变达到80%左右，收取病毒上清液，标记为P1，保存于-80℃。将P1病毒上清液按照1∶1000稀释，并接于新鲜的MARC-145细胞，细胞病变达到80%，收取上清液，标记为P2并保存于-80℃，以同样的方法将病毒传代至P5、P6。

图2 重组突变全长克隆pA-E2-EGFP的构建及鉴定Fig.2 Construction and identification of recombinant mutant full-length clone pA-E2-EGFP

1.5 间接免疫荧光 将P3代病毒感染MARC-145细胞48 h后，弃去维持液培养基。冰甲醇固定10 min，1%BSA室温封闭30 min，用1∶600倍比稀释的PRRSV N蛋白的特异性单克隆抗体（SR30A,rural technology,LTD），1∶1000倍比稀释的CSFV E2蛋白的特异性单克隆抗体，1∶1000倍比稀释EGFP特异性抗体，37℃孵育2 h，再分别加入Alexa Fluor 488/568 -labeled羊抗鼠的荧光二抗（1∶800倍比稀释），37℃孵育1 h，PBS洗5遍后，倒置荧光显微镜观察[10-11]。

1.6 Western blot鉴定 将P3代病毒以0.01 MOI接种于6孔板中的MARC-145细胞，病毒感染36 h后收集细胞中的蛋白，进行SDS-PAGE，用金斯瑞快速转膜仪进行转膜，将转印好的膜放入5%脱脂乳中封闭2 h后，用TBST清洗细胞3遍，每次10 min。加入一抗，室温孵育2 h，用TBST洗涤3遍，每次10 min，再加入1∶6000稀释的二抗，室温振荡孵育60 min后，用TBST洗3遍，每次10 min。用ECL发光液A液和B液按1∶1比例混合显色[10-11]，用Tanon-5200自动化学发光图像分析系统进行显影。

1.7 一步生长曲线绘制 将P3代重组病毒以1 MOI接种于T25培养瓶中的MARC-145细胞（细胞个数约为2.5×105个），37℃孵育1 h后，弃去上清液，加入5 mL 2%FBS的MEM培养基，每隔2 h收取200 μL细胞上清液的同时补加200 μL 2%FBS MEM培养基，持续收取至接毒后24 h。测定收取每个时间点的病毒滴度（TCID50），用GraphPad软件绘制病毒一步生长曲线。

1.8 空斑形态学分析 将P3代拯救病毒用DMEM系列稀释后，取300 μL感染6孔板中的MARC-145细胞，37℃孵育1 h后，弃掉病毒液，加入等比例的2%低熔点琼脂糖与2×MEM，再加入4%FBS（5 mL/孔）于6孔细胞板中。室温凝固后，于37℃培养箱倒置培养4～5 d，待出现空斑后，在孔中加入2 mL 4%的甲醛溶液固定后甩掉凝胶，用5%结晶紫溶液染色。

2 结果

2.1 重组全长感染性克隆的构建和病毒的拯救 基于表达CSFV E2蛋白的高致病性PRRSV的传代致弱株rPRRSV-E2的全长感染性克隆平台，在ORF7和3'UTR之间插入由TRS6 cassette引导的绿色荧光蛋白编码基因与PRRSV相应基因组嵌合的片段1595 bp，然后将该片段与rPRRSV-E2的感染性克隆分别用MluⅠ和SwaⅠ进行双酶切，将目的条带与载体相连接，构建新的重组嵌合感染性克隆质粒pA-E2-EGFP（图1）。将构建的全长感染性克隆用MluⅠ和SwaⅠ进行双酶切，可以看到pA-E2-EGFP出现大小为1500 bp的条带，说明表达绿色荧光蛋白的编码外源基因成功插入（图2）。将构建成功的重组突变体克隆pA-E2-EGFP进行线性化，并在验证后做体外转录。体外转录的RNA转染并传代于MARC-145细胞，拯救出的病毒命名为rPRRSVE2-EGFP（图3）。

图3 重组突变全长克隆pA-E2-EGFP的拯救Fig.3 Rescue of the full-length cDNA clone pA-E2-EGFP

2.2 重组突变病毒与亲本病毒蛋白表达水平的比较 为了比较重组突变病毒与亲本病毒的蛋白表达水平，将亲本病毒HuN4-F112和rPRRSV-E2以及重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP以0.01 MOI接于新鲜的MARC-145细胞，做间接免疫荧光检测PRRSV核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）和CSFV囊膜蛋白（E2）是否表达，直接荧光观察重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP中EGFP外源蛋白的表达。由结果可知，重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP能够正常地表达PRRSV N蛋白，CSFV E2蛋白以及所插入的外源EGFP编码蛋白，并且相同蛋白的表达水平相当（图4），说明重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP和亲本病毒HuN4-F112，rPRRSV-E2具有相似的复制转录能力。

图4 间接免疫荧光分析rPRRSV-E2-EGFP重组突变病毒感染MARC-145细胞后的蛋白表达Fig.4 IFA of protein expression of rPRRSV-E2-EGFP recombinant mutant virus infected MARC-145 cells

用Western blot检测验证病毒感染细胞后表达相关蛋白的水平，结果可知，重组突变病毒rPRRSVE2-EGFP能够正常表达基因组中插入的外源基因，并且与亲本病毒相比表达蛋白量差异不显著（图5）。

图5 重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP感染MARC-145细胞后进行Western blot鉴定蛋白表达Fig.5 Western blot analysis of protein expression of recombinant mutant virus rPRRSV-E2-EGFP infected MARC-145 cells

2.3 重组病毒与亲本病毒的病毒生物学特性水平分析对重组突变病毒rPRRSV-E2-EGFP和亲本病毒进行空斑形态学比较分析（图6），结果表明，重组突变病毒在空斑形态、数目上与亲本病毒无显著差异。一步生长曲线结果表明，重组突变病毒rPRRSVE2-EGFP与亲本病毒HuN4-F112、rPRRSV-E2均无明显差异，在4～8 h均会出现毒价降低的现象，16～22 h均处于平台期，病毒含量未出现明显波动（图7）。

图6 重组突变病毒与亲本病毒空斑形态学比较Fig.6 Plaque morphology comparison for the mutant virus and parental virus

图7 重组突变病毒与亲本病毒的一步生长曲线Fig.7 One-step growth curve for the mutant virus and parental virus

3 讨论

反向遗传技术的成熟使我们对RNA病毒基因组的操作变得较为简便。作为套式病毒目成员，动脉炎病毒与冠状病毒的基因组结构相比，其基因组RNA更加的紧凑和精简，基因组中有很多重叠区（overlap）。将外源基因插入动脉炎病毒基因组中，形成稳定的重组嵌合病毒，难度较大。

2000年，Groot等[12]将编码流感病毒HA蛋白的9个氨基酸表位的一段短序列插入PRRSV基因组ORF7基因的两端，HA标签和N蛋白的融合蛋白在重组病毒中成功表达，但是病毒增殖被阻滞，并且在病毒的后续传代过程中，HA标签逐渐丢失，直至完全缺失。de Vries等[13]对EAV表达外源序列进行了研究，在拉开了重叠序列ORF5和ORF6之后，插入带有EAV特异转录调控序列的GFP，转染BHK细胞后能够获得病毒，但是在连续传代之后，GFP基因开始出现逐步的缺失。2010年，Zheng等[14]分别在pAPRRS的ORF1和ORF2之间，ORF5和ORF6之间，ORF6和ORF7之间插入PCV2的ORF2基因，发现了由于人为引入基因组中的类TRS序列导致PRRSV TRS cassette及其侧翼序列的RNA二级结构发生了改变，从而进一步导致了重组病毒的遗传不稳定性，同时也发现了PRRSV基因组可以利用外源类TRS序列作为启动子进行转录。

以上结果表明动脉炎病毒基因组存在不稳定性，单纯的插入外源基因融合表达的策略并不可行，重组病毒可能增殖能力下降，甚至完全无法拯救病毒。另外，外源基因插入位点的选择也非常重要。

2009年，Pei等[15]选择PRRSV基因组ORF1b和ORF2作为外源序列插入位点，插入了EGFP基因，并使EGFP位于TRS的调控之下，作为新的sgmRNA进行转录表达，构建的重组病毒能够至少在体外稳定传代37次。本团队前期研究中构建的rPRRSV-E2至少能够在连续20次的细胞传代过程中保持遗传稳定，在体内体外稳定表达CSFV的E2基因[16]。由此可见，ORF1b和ORF2之间是PRRSV非结构蛋白基因和结构蛋白之间的间隙，选择该基因间区，并将外源基因作为独立的转录本在TRS的调控之下进行转录表达的策略对于保持重组病毒的遗传稳定性有重要意义。

ORF7和3'UTR之间是病毒的结构蛋白与非翻译区分界。2017年，Wang等[17]利用反向遗传技术针对不同的TRS cassette引导EGFP在ORF7和3'UTR之间的表达进行了研究分析，发现TRS6 cassette引导外源基因的表达效率十分有效。在本实验室前期研究中，也通过充分的实验研究证明了在ORF1b和ORF2之间，TRS6 cassette对于外源基因的转录调控效率最高。2010年，Sun等[18]将基因1型PRRSV毒株3'UTR替换PRRSV2型基因毒株中，嵌合cDNA克隆，仍然可以成功拯救出嵌合病毒，该实验也证明了虽然PRRSV 1型和2型毒株的3'UTR一级核苷酸序列差异大，但其高级结构具有相似的功能，并且2型PRRSV的N蛋白C端4个氨基酸活性不会受到影响[19]。以上一系列针对PRRSV作为活病毒载体在不同基因调控位点的研究，启发我们利用本实验室已有的rPRRSV-E2的感染性克隆，尝试同时在其基因组ORF7和3'UTR之间插入了由转录调控效率最高的TRS6 cassette引导的EGFP基因，成功拯救了该重组突变病毒，并进行了该重组突变病毒蛋白翻译的分析鉴定。我们发现该病毒与亲本病毒相比除了能正常表达基因组载体PRRSV N蛋白外，也能够表达在其基因组两个位点中插入的外源基因CSFV E2蛋白和EGFP编码蛋白。病毒生长特性与亲本病毒分析发现，该重组突变病毒与亲本病毒在生长特性、病毒空斑形态数目上无显著性差异。这些试验结果为研究PRRSV作为表达外源基因的活病毒载体提供了构建思路，也为以后研究多价疫苗奠定了一定的理论基础。