超声波处理对糯米粉中蛋白质特性的影响

刘 洁,赵爽爽,杨秋晔

河南工业大学 粮油食品学院, 河南 郑州 450001

淀粉对糯米粉的凝胶性质起主导作用,但有研究表明糯米粉中总蛋白质的含量及组成对糯米粉凝胶的流变和糊化特性有显著影响[1-2]。黏附在淀粉颗粒表面的蛋白质通过形成更紧密、更稳定的蛋白质网络结构,影响淀粉的糊化特性,导致淀粉难以糊化,进而抑制凝胶的形成[3]。Wu等[4]发现添加16%大米蛋白质保护了糊化过程中的大米淀粉颗粒完整性,并延缓了糊化过程,添加12%大米蛋白质抑制了大米淀粉的回生,通过控制大米蛋白质的添加量从而影响储藏过程中大米淀粉的糊化和回生,有利于形成凝胶网络结构。糯米中的蛋白质对糯米粉凝胶的流变学特性和质构特性产生显著的影响[5]。

超声波通过诱导蛋白质构象发生变化,从而改变蛋白质的功能性质。超声波处理可以诱导蛋白质发生去折叠化,破坏蛋白质的二硫键[6]。超声波处理使米糠蛋白浓缩物的颗粒表面出现孔隙,结构更加无序[7]。蛋白质经过超声波处理后其表面变得粗糙,黏度、溶解度和表面疏水性增加,易于形成凝胶[8-9]。超声波处理酪蛋白溶液推迟了形成凝胶的时间并增加了凝胶的硬度,酪蛋白的凝胶结构更致密[10]。据报道超声波通过影响重组乳清蛋白的氢键、疏水和静电相互作用等物理作用力,脱水收缩形成强度更高的凝胶[11]。超声波处理增加β-折叠和无规卷曲的比例,同时降低了α-螺旋和β-转角的比例,表明有序结构减少和无序结构增加[7]。超声波处理后蛋白质二级结构中β-折叠的含量由45.02%降低至37.16%,游离巯基含量显著增加,二硫键含量降低,蛋白质的分子结构得到伸展,蛋白质分子中更多的亲水基团暴露于极性环境中[12]。超声波处理使米糠蛋白链间氢键和二硫键断裂,蛋白质结构由有序向无序转变,使米糠蛋白的内部生色基团暴露并倾向于亲水环境,表明亲水基团暴露[13]。

本研究前期以糯米粉为原料,通过超声波处理改善糯米粉的凝胶特性,分析淀粉的形态结构、糊化、热力学及流变学特性,并未发现超声波对淀粉的颗粒结构和特性产生显著影响,表明超声波处理使得糯米粉凝胶特性发生改变的原因并不是糯米粉中的淀粉[5]。在此基础上,研究糯米全粉中蛋白质,分析从超声波处理的糯米粉中提取的蛋白质的游离巯基、二级结构、表面疏水性和热力学特性等,研究超声波处理对糯米粉中蛋白质结构和特性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

糯米粉(蛋白质含量6.95%、淀粉含量84.34%、脂肪含量0.82%、灰分含量0.17%、水分含量7.67%):河南黄国粮业股份有限公司;糯米蛋白:从糯米粉中提取,实验室自制;三氯乙酸:天津天力化学试剂有限公司;β-巯基乙醇:天津大茂化学试剂有限公司;三羟基氨基甲烷:天津光复精细化工研究所;5,5’-二硫基-2-硝基苯甲酸(DTNB):北京百奥莱博科技有限公司;脲:天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

QUANTA250扫描电子显微镜:美国FEI公司;Nicolet FT-IR 红外光谱仪:美国Thermo Scientific公司;UV-2700紫外分光光度计:日本岛津公司;G9800A荧光分光光度计:安捷伦科技有限公司;Bioruptor UCD-200 SOP非接触式超声波破碎仪:比利时Diagenode公司;TA Q20 差示扫描量热仪 (DSC):美国 TA 公司;FD-IA-80冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司;Seven Multi pH计:瑞士METTLER-TOLEDO公司;MB45卤素水分测定仪:美国OHAUS公司。

1.3 超声波辅助提取蛋白质

1.3.1 超声波处理糯米粉

称取一定量的糯米粉分别配制成料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8 g/mL的糯米粉乳液,拟使用130 W的超声波功率,超声处理10 min。称取一定量的糯米粉配制成料液比1∶2 g/mL的糯米粉乳液,拟分别用130、160、200 W的超声波功率,超声处理10 min。称取一定量的糯米粉配制成料液比1∶2 g/mL的糯米粉乳液,拟使用130 W的超声波功率,分别超声处理10、20、30、40 min。

将上述糯米粉乳液分别置于50 mL离心管中,漩涡振荡均匀,置于恒定频率(20 kHz)的超声波破碎仪中(工作30 s停止30 s)按各自拟定条件进行处理。在超声波处理过程中,通过向水槽中加入碎冰使温度保持在0～9 ℃。将超声波处理后的糯米粉乳液抽滤,于45 ℃烘箱中干燥12 h后过80目筛,制备成超声波处理糯米粉。

1.3.2 提取经超声波处理的糯米粉中的蛋白质

根据代钰等[14]的方法并进行改进,将超声波处理的糯米粉分别过80目筛,以1∶8 g/mL的料液比在磁力搅拌器的搅拌下加入NaOH(0.05 mol/L),并持续搅拌95 min,调节溶液最终pH值为11,随后离心(3 000 r/min,15 min),用HCl(1.0 mol/L)调节离心后的上清液的pH值为4.6～4.8,再离心(3 000 r/min,15 min),随后在真空冷冻干燥机中干燥48 h,研磨过80目筛。

1.4 糯米蛋白的基本组分测定

采用GB/T 5009.5—2016中的凯氏定氮法、GB 5009.9—2016中的酸水解法、GB/T 5009.6—2016中的索氏抽提法、GB 5009.4—2016《食品中灰分》中的分析方法,分别对所提取的糯米蛋白质中蛋白质含量、淀粉含量、脂肪含量、灰分含量进行测定,水分含量采用卤素分析仪法,用MB45卤素水分测定仪测定。

1.5 蛋白质的特性分析

1.5.1 扫描电子显微镜测定

在冷冻干燥后的糯米蛋白质的表面喷上一层薄金,在真空条件下、加速电压15 kV,观察并记录不同放大倍数的样品表面形态。

1.5.2 热力学特性测定

称取2.5 mg(干基)糯米蛋白于液体铝坩埚中密封。测试温度30～200 ℃,升温速率为10 ℃/min。

1.5.3 溶解度测定

参考龙佩[15]使用的方法并略作改进。称取100 mg糯米蛋白质溶解于10 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.2 mol/L,pH 7)中,使用磁力搅拌计搅拌1 h,使糯米蛋白充分溶解,离心(4 000 r/min ,30 min)。用福林法测定上清液的溶解度,取上清液1 mL,加入5 mL 福林甲试剂,再加入0.5 mL 福林乙试剂混合均匀,静置30 min,测定500 nm处的吸光度,以牛血清蛋白制作标准曲线。

1.5.4 表面疏水性的测定

参照吴海波等[16]使用的方法并略作改进。取200 mg 蛋白质溶解于50 mL的PBS(0.2 moL/L,pH 7.0)中,搅拌1 h,离心(4 000 r/min,15 min)。使用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白质浓度,用PBS分别将上清液稀释为5个浓度,使之处于0.02～0.5 mg/mL范围。取5 mL蛋白质溶液于比色皿中,然后加入60 μL 8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)混合均匀于黑暗处反应10 min,即刻使用荧光光谱仪测定吸光度。测试条件:激发光波长为390 nm,发射光波长为400～600 nm,取发射光波长490 nm的荧光强度进行计算。

1.5.5 游离巯基含量和二硫键含量的测定

游离巯基含量测定:参考Pan等[12]使用的方法并进行修改。称取100 mg 蛋白,溶解于10 mL标准缓冲溶液(8 mol/L脲,90 mmol/L甘氨酸,86 mmol/L三羟基氨基甲烷,pH 8.0)中,使用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白质的浓度。吸取1 mL上清液于比色管中,加入4 mL标准缓冲液,最后添加0.04 mL DTNB混合均匀,反应30 min,测定溶液在412 nm处的吸光度。

游离巯基含量(μmol/g)=73.53A412×D/ρ,

式中:73.53=106/13 600,其中13 600是摩尔消光系数,L/(mol·cm);A412是在412 nm处的吸光度,L/(g·cm);D是稀释因子;ρ是蛋白质的质量浓度,mg/mL。

总巯基含量测定:吸取1 mL蛋白质上清液于比色管中,加入4 mL标准缓冲溶液和0.1 mLβ-巯基乙醇,置于30 ℃水浴中反应1 h,加入10 mL 12%的三氯乙酸混合均匀后,离心(5 000 r/min,15 min),再向沉淀中加入5 mL 12%三氯乙酸二次复溶,再离心。将沉淀溶解于标准缓冲溶液,加入0.04 mL DTNB试剂,测定412 nm处的吸光度。

1.5.6 二级结构测定

参考Chen等[17]使用的方法并进行修改,称取样品和溴化钾(质量比为1∶100)于玛瑙研钵中充分研磨,用红外光谱仪在400～4 000 cm-1范围内进行全波段扫描。

1.5.7 荧光光谱的测定

参照夏宁[18]使用的方法并进行修改,称取250 mg 蛋白质溶解于25 mL 0.01 mol/L的PBS(pH 7)中,配制成质量浓度为0.15 mg/mL的蛋白质。测试条件:激发光波长290 nm,扫描发射光波长300～400 nm。

1.6 数据统计与分析

使用Origin 9.1软件制图,方差分析使用IBM SPSS Statistics 20软件,结果表示为平均值±标准偏差,不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质的表面形态分析

通过扫描电子显微镜可以观察糯米蛋白表面微观结构的变化。从原糯米粉中提取的蛋白质(P-WRF)呈现致密的块状结构,从超声波处理后的糯米粉中提取的蛋白质(P-UT-WRF)结构松散,孔洞密集(图1)。这可能是由于超声波的空化效应,改变了蛋白质的高级构象,使蛋白质结构变得松散[19]。在超声波功率130 W、超声波时间10 min、料液比1∶2 g/mL时,超声波处理对P-UT-WRF的微观结构产生的影响最为显著。随着超声波功率逐渐增大至200 W,或超声波时间延长至40 min时,P-UT-WRF的疏松孔状结构逐渐变成更为致密的疏松小孔,表明功率增大或时间延长可促进蛋白质聚集,使其结构变得更加紧实。随着料液比的减小,P-UT-WRF凝聚的现象更明显。

2.2 热力学特性分析

变性温度(Td)反映蛋白质的热稳定性,焓值(ΔH)反映蛋白质分子的聚集程度(蛋白质中有序结构所占比例),Td越高,蛋白质稳定性越强,ΔH越高,蛋白质分子的聚集程度越高,有序结构比例越大[16]。P-WRF的Td为165.31 ℃,ΔH为138.47 J/g,当超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的Td减少10.74%,ΔH减少10.72%(表1)。超声波功率增加到160 W、200 W,P-UT-WRF的Td和ΔH均无显著性变化(P>0.05)。超声波时间延长到30 min时,P-UT-WRF和P-WRF的Td大致相同,ΔH则无显著性变化(P>0.05)。料液比降低至1∶8 g/mL时,P-UT-WRF的Td和ΔH无显著变化(P>0.05)。Zou等[20]发现鸡肝蛋白经过低频超声处理后,其热稳定性显著下降。随着超声波功率的增加、时间的延长及料液比的减小,超声波处理未引起糯米蛋白的变性焓显著变化(P>0.05),可能是因为超声波处理的是糯米全粉,对糯米全粉中蛋白质的破坏程度有限。

表1 超声波功率、时间和料液比对糯米蛋白热力学特性的影响Table 1 Effects of ultrasonic power, time and solid-liquid ratio on thermodynamic properties of waxy rice protein

2.3 溶解度分析

P-WRF的溶解度为1.18%,超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的溶解度显著提高到1.65%(P<0.05,图2),增加了39.83%。当超声功率增加到200 W,P-UT-WRF的溶解度逐渐下降,并低于P-WRF的溶解度,相比于P-WRF减少39.83%。当超声波时间超过10 min,P-UT-WRF的溶解度下降49.70%(P<0.05),然而从20 min到40 min,P-UT-WRF的溶解度无显著性变化(P>0.05)。当料液比降低到1∶4 g/mL时,P-UT-WRF的溶解度与P-WRF的相当,这可能是超声波将可溶性蛋白质聚集体形成不溶性沉淀物,从而降低了蛋白质的溶解度[21]。料液比继续降低到1∶6、1∶8 g/mL时,P-UT-WRF的溶解度又高于P-WRF的溶解度,这可能是超声波将聚集的蛋白质重新展开,暴露了一些极性基团,提高了蛋白质的溶解度[22]。溶解度的增加还会导致乳化性质和起泡能力的提高[23-24]。研究发现低强度超声波处理鸡肉肌动球蛋白可显著提高其表面疏水性、巯基含量和溶解度;高强度超声波处理时,其表面疏水性和溶解度均显著降低[25]。这可能是因为蛋白质发生了非共价结合形成了聚集体,导致蛋白质的溶解度下降[21]。

2.4 表面疏水性分析

蛋白质表面疏水性表明蛋白质表面疏水氨基酸残基分布的程度,与蛋白质功能特性相关[26]。试验中常用萘磺酸(ANS)测定蛋白质表面疏水性,ANS与蛋白结合的荧光强度可以表达蛋白质的表面疏水性[26]。P-WRF的表面疏水性为745.68,超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的表面疏水性增加16.16%(P<0.05)(图3),表明适当的超声波处理可以促进糯米蛋白质分子展开,使其内部的疏水基团暴露出来增加表面疏水性。这可能是超声波产生的机械作用破坏了淀粉与蛋白质的联结,导致蛋白质分子伸展,使其暴露出更多的疏水基团[27]。鸡肝蛋白、重组乳清蛋白浓缩物、大豆分离蛋白有相似的结果[28-30]。然而当超声波功率增大到200 W、超声波时间增加到40 min,料液比降低到1∶8 g/mL,P-UT-WRF的表面疏水性与P-WRF相比分别降低了14.55%、14.10%、7.33%(P<0.05),可能是超声波引起了局部热效应,并且产生的微射流和冲击波破坏了蛋白质分子的疏水相互作用[31],也可能是蛋白质又发生一定程度的聚集,部分疏水基团重新被包埋[32]。与P-WRF相比,料液比1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的表面疏水性最高,表明超声波使蛋白质分子伸展,内部的疏水基团暴露于极性环境中,表面疏水性增加[32]。继续降低料液比(1∶4～1∶8 g/mL),表面疏水性均低于P-WRF,表明超声波使蛋白质表面疏水性基团减少,表面疏水性降低,这可能是较低浓度的蛋白质所受到的超声效果增大,趋向于形成蛋白质聚集体,重新包埋疏水基团[33]。在料液比为1∶4 g/mL时,表面疏水性最低,料液比为1∶6和1∶8 g/mL时,表面疏水性有所回升但仍低于P-WRF,表明料液比也是影响蛋白质表面疏水性的重要因素之一。

图3 超声波功率、时间和料液比对糯米蛋白表面疏水性的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power, time and solid-liquid ratio on surface hydrophobicity of waxy rice protein

2.5 游离巯基和二硫键含量分析

在超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的游离巯基(—SH)含量,相比于P-WRF的—SH含量增加38.84%,此条件对糯米蛋白的—SH含量的影响最为显著(P<0.05,图4)。随着超声波功率的增大、时间的延长以及料液比的减小,P-UT-WRF的—SH含量显著降低,但仍高于P-WRF。P-UT-WRF的二硫键(—S—S—)含量逐渐下降(图4)。在超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的—S—S—的含量,相比于P-WRF的—S—S—的含量减少4.37%(P<0.05)。与P-WRF相比,P-UT-WRF的—S—S—含量在超声波功率为200 W时减少10.63%,在超声波时间为40 min时减少5.24%,在料液比为1∶8 g/mL时减少37.38%。—SH的增加和—S—S—的减少则说明蛋白分子结构展开,从而导致其结构的稳定性降低[34]。据报道超声波处理同样能够降低重组浓缩蛋白和麦胚蛋白中—S—S—的含量[35-36]。其主要原因可能是超声波的空化作用能够产生较强的剪切力从而断裂蛋白质分子间与分子内的—S—S—,使蛋白质内部的—SH暴露出来[37]。

图4 超声波功率、时间和料液比对糯米蛋白游离巯基和二硫键含量的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power, time and solid-liquid ratio on the content of free sulfhydryl and disulfide bonds in waxy rice protein

2.6 二级结构分析

与P-WRF的β-折叠、无规卷曲、α-螺旋和β-转角相比,在超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL时,P-UT-WRF的β-折叠和无规卷曲含量分别增加9.21%和39.60%,而α-螺旋和β-转角含量分别减少29.16%和10.60%(P<0.05,表2)。稳定的α-螺旋构象遭到破坏,变成伸展的多肽链,较伸展的β-折叠构象增加,表明蛋白质分子刚性结构减弱、柔性结构增加[38]。这可能是超声波处理能够引起蛋白质二级结构的变化,进而改变蛋白质的分子间相互作用,使蛋白质的分子结构变得松散[39]。随着超声波功率增加到200 W,β-折叠的含量无显著性变化(P>0.05);随着时间增加到40 min,β-折叠和β-转角的含量无显著性变化(P>0.05);随着料液比减少到1∶8 g/mL,β-折叠、α-螺旋、β-转角的含量均无显著性变化(P>0.05)。

表2 超声波功率、时间和料液比对糯米蛋白二级结构含量的影响Table 2 Effects of ultrasonic power, time and solid-liquid ratio on secondary structure content of waxy rice protein %

2.7 荧光光谱分析

与P-WRF相比,超声波功率为130 W和160 W时,波长355 nm处P-UT-WRF的荧光强度分别增加21.98%和19.67%(P<0.05,图5)。随着超声波功率增大到200 W时,时间延长到40 min,料液比减少到1∶8 g/mL时,波长355 nm处P-UT-WRF的荧光强度分别减少5.60%、24.29%和5.55%,荧光强度均低于P-WRF。蛋白质分子中能发射荧光的色氨酸残基的荧光峰位在350 nm附近[40],P-UT-WRF的荧光强度显著增加可能是超声波处理使蛋白质分子结构展开,原本埋藏在蛋白质内部的天然发色团色氨酸暴露出来,荧光强度的变化结果与表面疏水性的测定结果相一致。

图5 超声波功率、时间和料液比对糯米蛋白荧光光谱的影响Fig.5 Effects of ultrasonic power, time and solid-liquid ratio on fluorescence spectra of waxy rice protein

2.8 糯米蛋白的组分含量

从以上结果得知在超声波功率为130 W、时间10 min和料液比1∶2 g/mL的条件下处理的糯米粉中提取的蛋白质(P-UT-WRF)的变化最显著。分析此条件下得到的P-UT-WRF中的组分含量(表3),发现与P-WRF中的组分含量相比未发生显著性变化。因此,糯米粉中的蛋白质含量并未发生改变,主要是发生了构象变化,导致了其特性的改变。

表3 糯米蛋白质中各组分含量Table 3 Content of the components in protein from waxy rice flour %

3 结论

在超声波功率为130 W、超声波时间为10 min、料液比为1∶2 g/mL的条件下处理的糯米粉,其中蛋白质(P-UT-WRF)结构和特性的变化最为显著。与P-WRF相比,P-UT-WRF变性温度(Td)和焓值(ΔH)下降的比例相当(约为10.7%),溶解度增加比例约是表面疏水性增加比例的2.5倍,游离巯基增加的比例约是二硫键减少比例的9倍,无规卷曲增加的比例约是β-折叠增加比例的4.3倍,α-螺旋减少的比例约是β-转角减少比例的2.8倍,在355 nm处的荧光强度增加21.98%,均表明超声波使糯米蛋白质构象发生变化,分子结构展开。结合前期研究结果发现超声波处理可使糯米全粉的凝胶特性得到改善,而其中的主要组分淀粉的形态结构及与凝胶特性相关的特性均未发生显著变化,因此蛋白质基质的构象改变是糯米粉凝胶特性改善的主要原因。