菜心及其根际土壤环境对长期连作的响应

李海俊 张 莹 高富成 穆晓国 高 虎 叶 林

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

连作障碍是指在同一土壤中连续种植相同或相近作物，在正常管理条件下，生长潜力变弱、病虫害加剧、产量和品质下降的现象［1-2］。连作会导致作物生长状况变差，作物产量降低［3］，土壤出现次生盐渍化、土壤酶活性紊乱、微生物群落失衡［4］，土传病害加重及生态环境恶化等一系列问题，最终导致作物品质和产量降低［5］。连作障碍形成的原因复杂，是土壤系统内多种因子综合作用的结果［6］。研究表明，连作对园艺、粮食、饲用、果树等作物均产生了影响。随着连作年份的延长，黄瓜（Cucumis sativusL.）根际土壤细菌的相对丰度表现为先上升后逐渐下降［7］。番茄（Solanum lycopersicumL.）连作会使土壤细菌丰富度和多样性下降，伴随病虫害的发生［8-9］。韭菜（Allium tuberosumRottle）连作土壤全磷、有效磷和速效钾含量显著增加［10］。玉米（Zea maysL.）连作导致土壤中保护性微生物减少，致病性病原体增加，潜在致病菌增加［11］。甜菜（Beta vulgarisL.）连作改变了土壤酶活性和微生物的群落结构［12］。甘薯［Ipomoea batatas（L.） Lam］连作后根际土壤细菌群落结构和理化性质发生了变化［13］。长期连作严重抑制了花生（Arachis hypogaeaL.）生长发育，改变了根际土壤的化学性质以及细菌和真菌群落的结构和功能［14］。苜蓿（Medicago sativaL.）连作10年内土壤全氮和速效钾含量呈下降趋势［15］。菠萝（Ananas comosusLam.）连作土壤真菌群落结构和多样性的变化对其产量和品质产生了影响［16］。

菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et lee.）是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种［17］。菜心的食用部分主要是薹茎，其味道清甜，富含维生素和矿物元素，是宁夏地区供往粤港澳的主要蔬菜种类之一［18］。宁夏地区是供港蔬菜的明星产区，宁夏蔬菜在港澳、珠三角、长三角等地区广受欢迎［19］。截止到2020年，宁夏供港菜心种植面积达到了25.72万亩，产量达到了62.24万吨［20］。但由于连续多年种植，宁夏供港菜心产生了严重的连作障碍，主要表现为田间根系浅、不下扎，菜薹味淡、口感变差［21］。

鉴于此，本研究针对宁夏地区供港菜心连作土壤养分不均、酶活性紊乱、微生态失衡等问题，对宁夏吴忠青铜峡市不同种植年限的菜心根际土壤质量展开研究，探究不同连作年限菜心土壤理化性状、酶活性、微生物群落变化规律及其对菜心农艺性状的影响，尝试从多个角度阐明菜心连作障碍的发生原因，旨在为缓解和消除连作障碍，保障宁夏地区供港菜心的可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于宁夏吴忠市青铜峡市（106°4ʹ11.87ʺE，38°5ʹ28.32ʺN），是宁夏供港菜心的重要生产基地。该区西南高、东北低，主要为黄河冲积平原，土壤类型为灌淤土，海拔1 160～1 300 m。气候类型属于中温带大陆性气候，干旱少雨，冬寒长，夏热短，年、日温差大，日照充足，无霜期短，年均气温9.2 ℃，年平均日照时数2 892.2 h，年平均降水量181.7 mm。本研究以青铜峡市瞿靖镇友谊村2 组宁夏鑫茂原菜场的菜心及其根际土壤为样本，种植菜心品种为尖叶70，购自广东科农蔬菜种业有限公司。该地每年肥料投入分别为N：500 kg·hm-2，P2O5：90 kg·hm-2，K2O：90 kg·hm-2，有机肥：7 000 kg·hm-2。

1.2 样品采集及处理

试验于2021年10月1日第3茬菜心收获期进行采样，采集种植1年（撂荒地第1年种植菜心）、连作3年、6年和9年的菜心植株及根际土壤为试验材料，且以种植1年的试材为对照。选取面积一致、连作年限不同的地块，采用对角线五点取样法用土钻在深度为0～15 cm处取样，放置于无菌袋，冷藏运输至实验室。在无菌环境下采用四分法将采集的土样分成2份，1份样品在遮光、通风的环境中自然风干分别过20 和60 目筛，用于土壤化学性状和酶活性的测定，1 份于-80 ℃超低温保存，用于细菌和真菌的多样性测定；用环刀法进行土壤容重的测定。同时分别采集5 株各连作年限完整菜心植株，进行农艺指标和品质的测定。

1.3 测定项目与方法

土壤样品理化性质测定方法参照《土壤农化分析》［22］。其中，土壤容重采用环刀法测定；土壤pH 值用PB-10 pH 计（德国Sartorius 公司）测定；土壤电导率（electrical conductivity，EC）采用DDSJ-308F 电导率仪（上海仪分科学仪器有限公司）测定；全氮含量采用半微量凯氏法测定；全磷含量采用硫酸-高氯酸消煮法测定；全钾含量经HNO3、HCl 和HF 微波消解后采用BWB-1 火焰分光光度计（英国BWB Technologies 公司）测定；碱解氮含量采用碱解扩散法测定；速效磷含量采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，使用UV-6000紫外分光光度计（上海ACCURATE 公司）比色测定；速效钾含量采用醋酸铵-火焰光度计法测定。总有机碳含量采用TOC-L有机碳分析仪（日本岛津公司）测定。

土壤酶活性的测定参照《土壤酶及其研究法》［23］和《土壤肥力研究方法》［24］，其中，土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；土壤碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定；土壤蔗糖酶和纤维素酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定；土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定。

利用高通量测序平台Illumina Novaseq-PE250分析土壤细菌和真菌群落组成，称取0.5 g土样，利用Mobio PowerSoil DNA提取试剂盒（深圳市安必胜科技有限公司）提取DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的DNA 质量，Novaseq检测样品质量，取30 ng进行PCR扩增。用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rRNA的V3～V4区，用ITS5F（5′-GGAAGTAAA AGTCGTAACAAGG-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3′）扩增真菌ITS的ITS1（a）区。PCR反应体系共25 µL：DNA 2 µL，上下游引物各1 µL，5×反应缓冲液5 µL，dNTP（2.5mmol·L-1）2 µL，Q5 DNA聚合酶0.25 µL，ddH2O 8.75 µL。PCR反应程序为：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28个循环；72 ℃延伸5 min，10 ℃保存，设置3次生物学重复。使用胶回收试剂盒（艾普蒂生物工程有限公司，武汉）切胶回收PCR产物，Tris HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。而后进行Miseq文库构建，上机测序，测序工作委托上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.4 数据处理

使用R语言对全部样本中所包含的高质量序列的长度分布进行统计，用QIIME 2.2020.8 软件计算ɑ 多样性指数和距离矩阵与PcoA 分析。采用Excel 2019和SPSS 26.0 进行数据处理和分析，利用Origin 2021软件绘图。文中图、表中数据均为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 长期连作对菜心根际土壤理化性状的影响

由表1 可知，随着连作年限的增加，土壤容重呈先下降后上升趋势，在SC9 达到最大值1.33 g·cm-3，且SC6 和SC9 较对照显著上升。土壤pH 值、全磷、全钾和有效磷含量随连作年限的增加呈逐渐下降的趋势，与对照（SC1）相比，SC6 和SC9 的pH 值和全钾含量均显著下降；全磷和有效磷含量在各连作年限之间均表现为显著下降，且与对照相比，SC9 中土壤全磷和有效磷含量分别下降26.55%和26.07%。随着连作年限的增加，土壤电导率和全氮含量呈先下降后上升的趋势，SC9 土壤电导率和全氮含量达到峰值，较对照分别上升了34.21%和54.29%；碱解氮和总有机碳含量呈先上升后下降的趋势，均在SC3达到最大值；速效钾含量则呈显著上升趋势，且SC9是对照的2.41倍。

表1 不同连作年限菜心根际土壤理化性状Table 1 Physicochemical properties of rhizosphere soil of vegetable hearts with different years ofcontinuous cropping

2.2 长期连作对菜心根际土壤酶活性的影响

由图1 可知，随着连作年限的增加，土壤蔗糖酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶和纤维素酶活性均呈下降趋势，与对照相比，SC9 的菜心根际土壤蔗糖酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶和纤维素酶活性分别显著下降了55.43%、59.28%、33.73%、52.37%。而土壤脲酶活性则呈先上升后下降的趋势，在连作6年时达到最大值，较对照显著升高了50.51%。

图1 不同连作年限菜心土壤酶活性变化Fig.1 Changes of soil enzyme activity in different continuous years

2.3 长期连作对菜心根际土壤微生物群落的影响

经高通量测序后，试验土样共获得细菌28 个门、81 个纲、172 个目、267 个科和394 个属，绘制各处理门水平上相对丰度前10 的物种图（图2-A），试验样地土壤细菌群落主要由变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿湾菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）组成。随着连作年限增加，变形菌门和绿湾菌门呈先下降后上升趋势，而酸杆菌门呈先大幅上升后缓慢下降趋势；连作对酸杆菌门、蓝细菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度产生了较大影响，其中SC6的酸杆菌门相对丰度较对照增加10.74 个百分点，蓝细菌门相对丰度较对照增加4.93 个百分点，而硝化螺旋菌门的相对丰度较对照降低了1.58 个百分点。各处理土样经高通量测序后，共获得真菌10个门、16个纲、27个目、41个科和62个属，绘制各处理门水平上的物种图（图2-B），子囊菌门（Ascomycota）、球囊菌门（Mortierellomycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mucoromycota）为菜心土壤真菌的优势菌门。随着连作年限的增加，子囊菌门和球囊菌门呈先下降后上升的趋势，SC6子囊菌门的相对丰度最低，较对照下降了11.74个百分点，SC3球囊菌门的相对丰度最低，油壶菌门和被孢霉门相对丰度均在SC6 中达到最高，较对照分别增加了7.22 个百分点和0.73个百分点；而担子菌门则呈逐渐下降趋势，与对照相比，SC9的担子菌门相对丰度下降了4.62个百分点。

图2 不同连作年限对土壤细菌与真菌群落丰富度的影响Fig.2 Effects of different continuous cropping years on soil bacterial and fungal community richness

图2-C 和D 分别是细菌与真菌在不同连作年限下土壤操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）丰富度的稀疏曲线，4 个处理土壤样品细菌和真菌的OTU 数目随测序数据量的增加迅速上升，当抽取的序列条数达30 000 条以上时，细菌和真菌的稀释曲线均趋于平缓，表明样品测序充分、数据合理，目前测序量可以充分反映出4 个样品细菌和真菌群落物种多样性和丰富度的真实信息。

将细菌和真菌有效序列相似度97%作为OTUs 划分阈值，获得OTUs分布Venn图，比较分析菜心土壤真菌特有和共有的OTUs。由图2-E 可知，4 个连作年份土样的细菌群落中共确定了657个共有OTUs和14 814个特有OTUs，特有OTUs 的排序为SC1（5 354）>SC3（3 433）>SC9（3 142）>SC6（2 885）。由图2-F 可知，4个连作年份土样的真菌群落中共确定了67 个共有OTUs 和1 900 个特有OTUs，特有OTUs 的排序为SC1（802）>SC3（535）>SC6（287）>SC9（276）。

由图3-A 可知，细菌Chao1 和Observed species 指数均在SC6 最低，SC9 虽有所上升，但仍低于对照。随着连作年限的增加，细菌Shannon指数呈现先上升后下降后又上升的趋势；Simpson指数呈先上升后下降的趋势，但变化幅度较小；Good’s coverage 指数在0.98 以上；Pielou’s evenness指数在0.83～0.85之间。由图3-B可知，随着连作年限的增加，真菌Chao1 和Observed species 指数均呈现下降趋势，在连作9 年时达到最低；Shannon指数呈现先下降后上升的趋势，SC6的Shannon指数较对照显著下降了16.36%；Simpson 指数则呈先上升后下降后又上升的趋势；Good’s coverage 指数在0.99以上；Pielou’s evenness指数在0.52～0.64之间。

图3 不同连作年限土壤细菌与真菌群落的多样性变化Fig.3 Changes in soil bacterial and fungal community diversity at different continuous cropping years

图3-C 和D 主坐标分析显示了4 个连作年限菜心土壤细菌与真菌OTU 组成差异，由图3-C 可知，主坐标1（PCo1）可解释细菌群落的45.5%，主坐标2（PCo2）可解释细菌群落的13.0%，SC3、SC6 和SC9 细菌群落结构相似度较高，分布在第二、第三象限，而SC1 分布在第一象限。由图3-D 可知，主坐标1（PCo1）可解释真菌群落的48.1%，主坐标2（PCo2）可解释细菌群落的13.1%，SC3、SC6 和SC9 真菌群落结构相似度较高，主要分布在第一、第四象限，SC1 则分布在第二象限。进一步在属水平上对相对丰度较高的前20个细菌和真菌属构建分层聚类，分析各处理细菌和真菌组成的相似性和多样性，由图3-E和F可知，SC6和SC9的土壤样品细菌和真菌均明显地聚为一类，而后与SC3聚为一大类，而SC1土样细菌和真菌都是单独成一支，说明连作1年土壤细菌和真菌属群落结构与其他处理存在差异。

2.4 长期连作对菜心产量及品质的影响

长期连作在一定程度上影响了菜心的生长发育，由图4 可知，随着连作年限的增加，菜心的薹长、薹粗、地上部干鲜重、根干鲜重和菜心产量均呈下降趋势。与对照相比，SC3、SC6、SC9 薹长分别显著降低了17%、25%和39%，薹粗分别显著降低了5%、10%和18%；而地上部鲜重和根干重仅在SC9 较对照显著下降，分别下降了22%和28%，SC6 和SC9 根鲜重均较对照显著下降，分别降低了15%和41%，SC3、SC6和SC9地上部干重均较对照显著下降，分别降低了10%、14%和26%；菜心产量随连作年限的增加而呈下降趋势，在连作9 年时降至最低，SC3、SC6 和SC9 产量较对照分别显著下降了4.75%、7.57%和22.97%。长期连作对菜心品质的影响如图4-F所示，随着连作年限的增加，菜心可溶性糖、可溶性蛋白质、维生素C（vitamin C，Vc）含量均呈下降趋势，但仅SC9 较对照显著下降，分别降低了20%、22%和27%；而硝酸盐含量随着连作年限的增加呈现增加趋势。

图4 不同连作年限菜心农艺性状、产量及品质的变化Fig.4 Changes in agronomic traits，yield and quality of vegetable hearts at different continuous cropping years

2.5 菜心连作土壤微生物群落与环境因子的相关性分析

基于土壤微生物群落及环境因子的变化，进一步对二者的关系进行了相关性分析。分别选择门水平上细菌和真菌丰度变化较大的5 个群落与土壤环境因子进行相关性分析，结果表明（图5），全磷、有效磷、速效钾含量及蔗糖酶和脲酶活性对绿湾菌门群落变化产生了极显著影响，全磷、有效磷、速效钾含量及蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶活性对酸杆菌门和硝化螺旋菌门群落影响极显著，速效钾含量及蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶活性对蓝细菌门群落影响极显著，全磷和有效磷含量对蓝细菌门群落影响显著，EC 和全氮含量对球囊菌门群落影响极显著，脲酶活性对油壶菌门群落影响极显著，pH 值、全磷、有效磷、速效钾含量及蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶活性对担子菌门群落影响极显著，全氮含量及过氧化氢酶和纤维素酶活性对担子菌门群落影响显著，速效钾含量及蔗糖酶和脲酶活性对被孢霉门群落影响极显著，全磷、有效磷含量和碱性磷酸酶活性对被孢霉门群落影响显著。

图5 门水平上微生物与环境因子相关性分析Fig.5 Correlation analysis of microorganisms and environmental factors at the gate level

3 讨论

长期连作会导致土壤养分失衡，土壤酶活性紊乱，土壤微生物多样性降低，从而降低作物产量和品质［25-26］。研究表明，长期连作会使土壤土体变紧实，透气性减弱［27-28］。本研究中，随着连作年限的增加，菜心土壤容重升高，改变了土体结构。针对这一情况，可采用深耕的方式打破犁底层以提高土壤透气性。前人研究表明，全磷、有效磷和有效氮含量均随着西瓜连作年限的增加而逐渐降低［29］，本研究也得到了相似的结果，这可能与菜心对肥料的吸收特性有关。土壤pH 值与土壤中微生物群落变化密切相关［30］，本研究显示，随着连作年限的增加，菜心土壤pH 值逐渐下降，说明连作导致菜心土壤酸化。土壤盐含量是表征土壤盐渍化的一个重要指标，土壤含盐量和电导率之间存在正相关性［31-32］，在本研究中，土壤电导率随着连作年限的增加呈现先下降后上升的趋势，这可能是由于宁夏地区蒸发量较大，长期连作导致盐分富集，生产中可采取灌水洗盐排盐的方式缓解。焦润安等［33］对马铃薯连作土壤研究发现，随着连作年限的增加，土壤有效磷含量呈显著下降趋势，本研究也得到了相似结论。此外，本研究发现，土壤总有机碳含量随连作年限的增加呈现先上升后下降的趋势，这与杨卫君等［34］对连作棉田的研究结果一致。速效钾含量随着连作年限的增加呈现显著上升趋势，与王爽等［35］在黄瓜连作土壤中得出的结论一致，这可能是长期过量施钾肥导致的钾素积累。

土壤酶活性是评价土壤生物活性的重要指标［36-37］，直接影响土壤有机质的矿化和营养成分形态的转化［38-39］。土壤脲酶能促进尿素的水解，其活性与土壤碱解氮含量呈正相关［7，40］，在本研究中，也得到了相同的结论，即：土壤脲酶活性与碱解氮含量均随连作年限的增加呈先上升后下降趋势，且均在连作3 年时达到最大值。磷酸酶是土壤中的主要水解酶类之一，蔗糖酶和纤维素酶参与土壤有机碳生物循环［41］。本研究发现，随着连作年限的增加，土壤蔗糖酶、碱性磷酸酶和纤维素酶活性均呈现下降趋势，从而降低了营养元素的有效性，主要表现为速效磷和总有机碳含量降低等。过氧化氢酶能够消除H2O2的危害［3］，本研究中，随着菜心连作年限的增加，土壤过氧化氢酶活性显著下降，表明连作后菜心土壤可能积累了更多有害物质，加重了土壤连作障碍。

土壤微生物多样性是评价土壤生态功能的重要指标［42］。在本研究中，随着菜心连作年限的增加，其根际土壤细菌群落Shannon 指数先升高后降低，而真菌群落Shannon 指数则先下降后上升，与前人在西瓜连作研究中得到的结论相似［43］。土壤微生物群落结构变化会导致土壤中有益微生物减少，致病微生物增多，这种不平衡的微生态系统会进一步加重连作障碍［44］。长期连作降低了土壤中有益微生物的丰度，而病害的潜在病原体微生物丰度升高。多年连作茶园土壤中被孢霉属（Mortierella Coem. 1863）等优势菌属丰度下降；花生连作土壤中，梭状芽孢杆菌属（Clostridium）和芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）丰度增加［45-48］。这种现象在菜心连作中也同样存在，在门水平上，菜心连作显著增加了根际土壤中变形菌门、绿湾菌门、油壶菌门和担子菌门的相对丰度，而硝化螺旋菌门和子囊菌门相对丰度则呈下降趋势，这与Chen等［49］的研究结果类似。属水平物种组成热图分析表明连作改变了菜心根际土壤微生物群落组成，李莹等［50］在辣椒连作土壤中也得到了相似的结论。

连作改变了土壤环境，进而影响了作物生长发育［40］。在本研究中，随着连作年限增加，菜心薹长、薹粗、地上部干鲜重和根干鲜重及产量均整体显著下降，与前人研究结果相似［3，33］。徐小军等［51］研究发现，连作会导致甜瓜含糖量下降，口感变差，本研究同样发现，当连作年限达到9年时，菜心品质显著变劣。土壤生态系统由生物群落和理化变量之间复杂的相互作用组成，这些变量都对土壤的整体质量有贡献［52］。李玉娇等［53］在黄瓜连作土壤研究中发现，细菌和真菌群落结构变化与土壤有机碳、速效磷、有机质和速效钾含量变化密切相关。本研究得到了类似结论，即：土壤环境因子和微生物之间存在明显互作关系，全磷、有效磷、速效钾含量及蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶活性对酸杆菌门和硝化螺旋菌门群落影响极显著，EC 和全氮含量对球囊菌门群落影响极显著。

4 结论

本研究结果表明，长期连作导致菜心根际土壤容重、电导率、全氮、速效钾含量升高，而土壤pH值、总有机碳、全磷、有效磷、碱解氮含量均有不同程度的下降；土壤脲酶活性升高，而蔗糖酶、纤维素酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶活性均显著降低；细菌与真菌群落丰富度下降，群落结构发生变化。此外，长期连作使菜心根际土壤环境发生变化，这些环境因子的综合作用导致菜心产量下降、品质变劣。