胶冻样类芽孢杆菌对水稻纹枯病病害的防治及田间测产研究

娄梦奇,王晓帆,李明蔚,聂丽萍,廖美德

(华南农业大学植物保护学院,广东广州 510642)

水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病并称为世界稻作三大病害,其中纹枯病从水稻苗期到生长后期均可感染,导致水稻无法正常抽穗或秕谷数量增多[1-2]。水稻病害的主要防控措施包括重大病害的预测预报、抗性品种的选育和种植、农业防治、物理防治、化学防治、生物防治等[3]。但由于水稻抗性种质资源、病害预测预报及农业防控措施的局限性,在病害大流行年份,化学防治一直是控制各种水稻病害的主要手段,然而化学药剂的过量、盲目施用,不仅增加农业生产成本,影响水稻的品质和生态环境安全,还会导致病原菌产生抗药性,引起病害再猖獗,严重制约了我国水稻产业的绿色可持续发展[4]。

PS04菌株是由笔者所在实验室分离保存的菌株[5],属于胶冻样类芽孢杆菌,是一种可以分解土壤中磷、钾矿物质的一类细菌,具有分解土壤中硅酸盐、铝酸盐及云母等矿物质,释放其中的磷、钾等多种微量元素供作物吸收利用,从而达到提高作物产量的目的[6]。PS04胞外多糖能诱导植物防御性酶活性,其诱导效果与BTH相当,是一种良好的诱抗剂[7]。为了探明PS04对水稻纹枯病的防治效果及PS04发酵液在水稻栽培中的应用效果进行了相关试验,旨在为微生物源农药在控制植物病害的应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株。PS04菌株由笔者所在实验室从华南农业大学杀虫植物标本园分离纯化得到,水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌由华南农业大学绿色农药全国重点实验室保存。

1.1.2PS04发酵液的制备。把放置于-70 ℃冰箱中斜面保存的PS04菌株采用划线法于查氏平板上进行活化,放于28 ℃恒温培养箱静置培养48 h后,待菌落长出后用打孔器打出1～2个菌饼,放于含有100 mL查氏液体培养基(不加琼脂)的250 mL三角瓶中,35 ℃、160 r/min振荡培养84 h,即为PS04发酵液[8-9]。

1.1.3培养基。查氏培养基:蔗糖30 g,硝酸钠1.5 g,磷酸氢二钾1 g,硫酸镁0.5 g,氯化钾0.5 g,琼脂16～20 g,水1 000 mL,121 ℃高温灭菌30 min。

PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂16～20 g,水1 000 mL,121 ℃高温灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1PS04对病原菌的平皿抑制试验。用移液枪吸取PS04发酵液500、1 000、2 000 μL分别注入3个含有100 mL无菌水的250 mL三角瓶中,使3个三角瓶中PS04的浓度为0.5%、1.0%、2.0%。从每个瓶中吸取1 mL的PS04发酵液分别注入PDA平板上,与培养基混匀。以不做处理的PDA培养基作为对照,共4个处理,每个处理3次重复。将培养皿中培养好的水稻纹枯病菌采用打孔法(直径7 mm)打孔,将带有病原菌菌丝的菌饼接种到不同浓度的平板中央,菌丝生长面与平板接触,放于培养箱中,培养温度为28 ℃,3 d后观察培养皿的菌丝生长情况并测量计算抑制率[10]。

1.2.2PS04对水稻纹枯病的离体防效。采集长势一致、无病斑的新鲜叶片,清洗干净放于铺有无菌滤纸片的玻璃培养皿中,每皿5片叶子,用无菌水润湿滤纸片以达到保湿效果。用移液枪吸取PS04发酵液2、10 mL分别注入2个含有100 mL无菌水的250 mL三角瓶中,吸取100 mL发酵液原液注入250 mL三角瓶中,使3个三角瓶中PS04的浓度为2%、10%、100%。用移液枪吸取每个浓度的发酵液1 mL均匀涂抹叶片,以不处理的叶片作为对照。共4个处理,每处理3次重复。涂抹叶片后将培养皿中生长旺盛的水稻纹枯病菌用打孔器打孔(直径7 mm)进行接种,将菌饼放置于处理后的每片叶子上,菌丝生长面与叶片接触,将处理后的叶片放置于28 ℃恒温培养箱中培养,注意保湿,4 d后观察叶片的发病情况[11]。

1.2.3PS04发酵液大田防效试验。大田防效试验设在国内部分省份的水稻种植区发病稻区进行,设2个处理:①PS04稀释200倍;②清水对照。共调查3次,喷药1次,采用背负式打药喷雾法。按照《农药田间药效试验准则 (一) 》GB/T17980.19—2000的技术操作规程规定,试验田于施药前1 d对各小区采用对角线5点取样法共查20丛,调查总株数、病株数和病级数、病情指数。根据现场试验效果确定是否进行多次施药及调查,并计算病情指数与防效[12]。

水稻纹枯病病情分级标准:0级,全株无病;1级,第4叶片及其以下各叶鞘、叶子发病;3级,第3叶片及其以下各叶鞘、叶子发病;5级,第2叶片及其以下各叶鞘、叶子发病;7级,剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶子发病;9级,全株发病,提早枯死。

病情指数=[∑(各级病株数×相对级数值)÷(调查总株数×最高级值)]×100

防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%

1.2.4PS04发酵液田间测产试验。测产试验在广东省江门张村水稻种植区进行,不处理的稻田为对照组,喷施稀释200倍的PS04发酵液为处理组。在水稻收割前对各大区进行测产,采用对角线5点取样法,每1 m2调查不少于30穗,记录每穗粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重,计算理论产量[13]。

2 结果与分析

2.1 PS04发酵液对水稻纹枯病菌的抑菌活性随着PS04发酵液浓度的增加,对水稻纹枯病菌生长的抑制越明显,在PS04发酵液浓度为0.5%时对水稻纹枯病菌的抑菌率为56.10%,浓度为1.0%时抑菌率为64.93%,浓度为2.0%时抑菌率为84.16%(图1、2)。

注:A.CK,B.0.5%PS04发酵液,C.1.0%PS04发酵液, D.2.0%PS04发酵液。Note:A.CK,B.0.5% concentration PS04 fermentation broth,C.1.0% PS04 fermentation broth,D.2.0% PS04 fermentation broth.

图2 不同浓度PS04发酵液对水稻纹枯病菌的抑菌率Fig.2 Inhibition rate of different concentrations of PS04 fermentation broth

2.2 PS04发酵液对水稻纹枯病离体防效用离体水稻叶片测定PS04发酵液对水稻纹枯病的防治效果见表1。由表1可知,对照组的水稻叶片在接种病菌4 d后,导致100%发病,病斑直径平均为9.27 cm。经不同浓度PS04发酵液处理的水稻叶片在接种纹枯病菌4 d后,表现出显著的保护性防效,其中当PS04在100%时防效为71.63%,在10%时防效为46.04%,在2%时防效为19.72%。与对照组相比有显著的防效。

表1 PS04发酵液对水稻纹枯病的防治效果

2.3 PS04发酵液大田防效试验在江门张村水稻种植区进行了大田防效试验,结果见表2。由表2可知,在江门张村地区施用PS04制剂之后,第一次药后的病情指数为6.27,对照区的病情指数为35.50。第二次药后病情指数为3.72,对照区的病情指数为25.70。可见药后病情指数显著低于对照,且二次施药后显著降低水稻纹枯病的发生。

表2 PS04发酵液在江门张村水稻种植区对纹枯病的防效

2.4 PS04发酵液大田测产试验在江门张村水稻种植区进行了大田应用试验,结果见表3。从表3可以看出,喷施PS04发酵液后的水稻千粒重显著高于对照组,千粒重增加了1.45 g。与对照组相比,每穗粒数无显著差异。PS04发酵液处理组水稻的结实率与对照组无显著差异,PS04发酵液处理组的有效穗数显著高于对照组。处理组的产量较对照组增加了13.43%。由此可以看出,PS04发酵液增加了水稻产量。

表3 江门张村水稻种植区产量及其构成因素

3 结论与讨论

PS04菌株是笔者所在课题组自华南农业大学植物园分离得到的一株类芽孢杆菌,经鉴定为胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis),又名克立本类芽孢杆菌。芽孢杆菌具有抗逆性强、抗菌谱广及生长代谢速度快等优点,被广泛应用于植物病害的防治研究中[14-15]。本实验室是前期对PS04菌株进行了分离鉴定及其抗菌代谢产物的研究之后用PS04发酵液对水稻纹枯病进行室内抑菌试验并进行了田间防效和测产试验。

在平板抑制试验中发现PS04菌株具有良好的抑菌活性,且随着浓度的增加而表现显著,当PS04发酵液浓度为2%时对水稻纹枯病的防效为84.16%,在对水稻纹枯病的离体防效试验中发现PS04发酵液原液对水稻纹枯病的防治效果最好,能够降低叶片发病率。在大田对水稻纹枯病病害防治及测产试验中,发现施用PS04制剂后能够显著抑制病害发生率并提高单位面积簇数、结实率、千粒重等产量形成相关因素。另外在大田试验中发现,在水直播田、机插田施用PS04发酵液后,秧苗素质均有不同程度提升,表现为茎秆粗壮,叶色较浓。苗高比对照田块高1～3 cm(常规稻尤为明显),增加水稻叶片长度、提高根长和白根数,后期抗衰性状表现明显,能显著降低病害发生率。因此,可为今后微生物源农药防治水稻纹枯病病害提供一定理论基础与技术支撑。