抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的研制及临床治疗效果研究

毛治安

(抚顺市农业特产学校，辽宁 抚顺 113123)

猪流行性腹泻病毒(PEDV) 可引起各种日龄猪发生腹泻，是目前引起养猪生产中病毒性腹泻的最主要病原，主要危害仔猪，10 日龄内仔猪发病后死亡率达95%以上。 为防治仔猪流行性腹泻对养猪业的危害，本试验采用自制抗PEDV 的特异性卵黄抗体，应用于发病仔猪和受威胁的健康仔猪群，研究其在预防和治疗PED 的效果。

1 试验材料

PEDV HeB09 流行株(中国农科院北京畜牧兽医研究所)、高产蛋鸡、普通营养琼脂；血琼脂培养基；小鼠；PED 抗原速测卡(金标)，韩国安捷BIONOTE 公司；硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸—乙酸钠等分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司；流行性腹泻病猪、新生仔猪。

2 试验方法

2.1 卵黄抗体的制备

选取200 只120 日龄左右的高产蛋鸡，应用PEDV HeB09 株进行免疫，收集琼扩效价1∶32 以上高免蛋，应用醋酸—醋酸钠缓冲液法制备卵黄抗体粗提液，应用水稀释法—硫酸铵沉淀法纯化工艺进行卵黄抗体的纯化并进行效价的测定。

2.2 卵黄抗体安全性检测

2.2.1 细菌检测 将制备的卵黄抗体液涂布普通营养琼脂平板、血琼脂平板培养基，37 ℃恒温培养箱培养24～72 h，观察有无菌落生长。

2.2.2 安全性实验 小鼠安全性试验: 选择4只小鼠，两只后腿部肌注0.5 mL PEDV 卵黄抗体，连用7 d，观察注射部位有无肿胀、溃疡，以及药物吸收情况；两只每天口服0.5 mL，连用7 d，观察小鼠是否出现异常。 仔猪安全性试验: 选取1 周龄仔猪4 头。 2 只后腿部肌注5 mL PEDV 纯化卵黄抗体，2 只口服10 mL粗提卵黄抗体液，连用7 d；观察注射部位有无肿胀、溃疡以及药物吸收情况，观察仔猪是否出现胃肠道不良反应。

2.3 动物治疗试验

2016 年11 月抚顺市高湾某猪场109 头仔猪发生腹泻，其中10 日龄内仔猪34 头，10 ～30 日龄仔猪75 头，病猪发生水样腹泻，精神沉郁，不食或减食，粪便呈灰黄色，较小日龄仔猪陆续出现死亡，尸体严重脱水. 剖检可见: 死亡猪小肠扩张明显，肠壁变薄，充满黄色液体，肠系膜充血，盲肠扁桃体出血，胃内多空虚或有未消化乳凝块。 根据发病表现及PEDV 快速检测试纸条检测，最后确诊为PEDV 感染。

将发病仔猪分成三组，应用高免卵黄抗体进行治疗。 第一组: 糖盐水补液组，腹腔注射，15 mL/次，每天2 次；第二组: 糖盐水补液＋纯化IgY 注射治疗组，每只发病猪在糖盐水补液的同时，肌注纯化IgY 液4 mL，每天1次；第三组: 糖盐水补液＋粗提IgY 口服治疗组，每只发病猪在糖盐水补液的同时，口服粗提IgY 液4 mL，每天1 次；连续观察1 周。 具体分组如表1。 补液用糖盐水配方为糖盐水250 mL，碳酸氢钠30 mL，庆大霉素40 万IU，阿托品0.5 mg，地塞米松0.5 mg。 治愈标准:猪只吃食、饮水基本恢复正常，粪便固态成型。

表1 患病仔猪治疗分组情况

抚顺市马金猪场1 号分娩舍200 多头仔猪发生腹泻，死亡23 头，患病仔猪发生不同程度的腹泻，7 日龄内初生仔猪不食，迅速脱水；较大日龄仔猪亦出现水样腹泻，精神沉郁，厌食，出现口渴现象，粪便为黄色或灰色，粪便pH 检测呈酸性。 根据流行特点、临床表现及PEDV 快速检测试纸条检测确诊为PEDV 感染。 应用制备的高免卵黄抗体、糖盐水补液对其中192 头发病仔猪进行治疗，分组情况见表2。

表2 患病仔猪治疗分组情况

2.4 动物预防试验

2017 年2 月，泗水猪场猪群出现腹泻，母猪减食、呕吐，随后出现水样腹泻，仔猪腹泻严重，迅速脱水，较小日龄仔猪陆续出现死亡，在猪群内迅速蔓延，根据发病表现及PEDV 快速检测试纸条检测确诊为PEDV 感染。对分娩舍165 头新生仔猪进行卵黄抗体预防试验。 试验分卵黄抗体注射预防组(1 组)、卵黄抗体口服预防组 (2 组)、未预防组 (3组)；1 组仔猪出生当天肌注4 mL 纯化IgY 提取液，隔日1 次，连用7 次；2 组出生当天口服4 mL 粗提IgY 液，隔日1 次，连用7 次；3组口服生理盐水对照。 观察各组仔猪的发病情况。 在不改变猪场其他生产操作的情况下，观察卵黄抗体对于新生仔猪病毒性腹泻的防控效果。

3 结果

3.1 抗体效价及无菌检测结果

PEDV 卵黄抗体的纯化IgY 提取液、粗提IgY 琼扩效价均达到1∶32。 将粗提、纯化产物分别接种于普通营养琼脂培养基、血琼脂培养基，37 ℃培养24 h，培养基表面无细菌生长。

3.2 安全性检测结果

小鼠后腿部肌注卵黄抗体部位无肿胀、溃疡出现，药物吸收良好；口服给药后小鼠精神状态正常，未出现胃肠道症状。

仔猪后腿部肌注5 mL PEDV 卵黄抗体后注射部位亦无肿胀、硬结、溃疡等情况发生，药物吸收良好，仔猪体温正常，精神状态、食欲正常。 口服给药仔猪未出现呕吐、腹泻等胃肠道反应。 说明制备的粗提IgY 液、纯化IgY提取液安全性较好，可以应用于猪流行性腹泻感染的临床治疗。

3.3 动物治疗试验结果

3.3.1 高湾猪场治疗效果 高湾猪场109 头发病仔猪应用糖盐水、PEDV 特异性卵黄抗体治疗后，各试验组均有一定的治疗效果，见表3。 2、3 组应用卵黄抗体注射治疗组、口服治疗组比单独使用糖盐水补液组治愈率分别高39.3%、34.1%，说明应用PEDV 特异性卵黄抗体对流行性腹泻疾病的治疗效果显著。

表3 高湾猪场患病仔猪治疗效果

3.3.2 马金猪场治疗效果 猪场1 号分娩舍192 头仔猪发生猪流行性腹泻疾病，根据窝数随机分成三组，各组均腹腔注射5% 糖盐水15 mL，每天2 次；2 组、3 组发病猪只在糖盐水补液的同时，分别肌注5 mL 纯化IgY 液、口服5 mL 粗提IgY 液，每天1 次。 治疗结果如表4，10 日龄内发病仔猪由于猪只体重小、抵抗力较差，各组治愈数都较低；1 组仅使用糖盐水补液组总治愈率仅为24.4%，2 组、3组治愈率分别达到70.1%、60.0%。

表4 马金猪场患病仔猪治疗效果

3.4 动物预防试验结果

对分娩舍15 窝、165 头新生仔猪进行PEDV 特异性IgY 预防试验。 结果见表5，图1。 IgY 口服预防组、注射预防组仔猪出现均发病仔猪，由表可见口服预防组的发病率为61.1%，注射预防组发病率42.9%，而生理盐水对照组因为缺乏抗体保护整窝仔猪全部发病，发病率100%。 在现场观察中，发病后全窝仔猪都会出现腹泻症状。 不过在经过后续的治疗(这三组发病仔猪同时进行药物的腹腔补液，和猪场以前的操作方案一样)，其中口服预防组的死亡率为63.6%，注射预防组的死亡率为58.3%，而对照组的死亡率达到94.5%。由此可以说明特异性IgY 可以降低新生仔猪的PEDV 发病率和死亡率，对猪场控制猪群流行性腹泻有一定的帮助。

图1 动物预防试验结果

表5 泗水猪场新生仔猪卵黄抗体预防效果

4 讨论与分析

本试验中PEDV 特异性卵黄抗体临床治疗应用结果表明，发病仔猪肌注纯化IgY、口服粗提IgY 液治愈率都达到55%以上，说明粗提、纯化的IgY 具有很好的抗病毒活性。

2 个猪场肌注给药、口服给药的总治愈率分别为68.1%、58.0%，肌注IgY 给药的治愈率比口服给药高10%，治疗效果更好。 分析其原因主要是虽然粗提卵黄抗体液中IgY 的含量高于纯化IgY，但经口服给药后，胃内酸性环境会破坏一部分IgY 的生物活性[1]，以及胃蛋白酶、胰蛋白酶对IgY 的分解作用，使能够在消化道内发挥抗病毒作用的有效IgY 量下降，随着猪只日龄的增长，胃内pH 下降，逐渐达到成年猪2.5 ～3.5 的水平，口服卵黄抗体活性被破坏快，因此可以考虑开发IgY 的缓释制剂及保护剂[2]。 而肌注给药的IgY 吸收后直接入血，不会引起抗体活性下降，血液中PEDV抗体效价迅速上升，通过抗原抗体的特异性结合发挥抗病毒作用。

卵黄抗体经粗提去脂后口服给药的治愈率为58.0%，与应用PEDV SD 株制备的卵黄抗体液对自然发病猪场病猪治疗效果(治愈率67%) 接近[3]，虽然本试验口服给药在治愈率上比纯化IgY 注射给药途径低，但是粗提去脂方法简单，生产成本比较低，相比较比纯化卵黄抗体更容易在基层养殖业中推广使用。

不同日龄段仔猪经糖盐水补液、卵黄抗体给药后的治疗效果显示10 日龄内仔猪的总治愈率仅为21.2%，10 ～30 日龄仔猪的治愈率可达80.5%。 主要因为10 日龄内仔猪体重、免疫力较低，一旦发生腹泻迅速发生脱水，而随着病猪日龄的增加，猪只的抵抗力增加，及时采取补液、特异性抗体疗法死亡猪只数量明显下降，治疗效果良好。

应用制备的卵黄抗体纯化产物、粗提去脂液预防给药后，新生仔猪的发病率比对照组分别降低了57.1%、38.9%，发病猪的死亡率分别降低了36.2%、30.9%，说明PEDV 特异性卵黄抗体的预防给药对猪场控制猪群尤其是新生仔猪的流行性腹泻有一定的帮助。 通过卵黄抗体预防实验、治疗试验结果看出，PEDV 卵黄抗体紧急预防、治疗给药是控制疫情蔓延、减少猪场经济损失的有效措施。 同时，针对此病的发生，应加强生产管理，包括猪舍温湿度的控制、定期消毒等操作，母猪产前做好病毒性腹泻疫苗的普免，提高猪群的免疫状态和抵抗力，以预防流行性腹泻的流行，提高猪场的经济效益。