猪伪狂犬病的诊断和防控效果评估

元 娜，张美美，耿 健，李向清，赵宝凯

(1. 河北农业大学动物医学院，河北 保定 071000；2. 北京大伟嘉生物技术股份有限公司，北京 100085；3. 东北农业大学动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030；4. 辽宁伟嘉农牧生态食品有限公司，辽宁 葫芦岛 125199)

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR) 是由疱疹病毒科，a -疱疹病毒亚科的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 引起的一种以发热、奇痒和脑脊髓炎为特征的急性传染病[1]。 此病危害新生仔猪的消化系统、呼吸系统以及神经系统，可引起母猪的繁殖障碍。 感染PRV 耐过猪是病毒的长期带毒者和排毒者[2]。 2011 年后，我国多地区出现猪PR 变异毒株并流行，引发母猪流产和猪只死亡，经济损失严重[3]。 随着PR 免疫和净化措施的有效落地，PRV 感染案例的报道逐渐减少。 但免疫方法不科学、程序不合理以及使用疫苗毒株不匹配，不能构筑有效的免疫屏障易引起猪场发病。 2022 年12 月，山西某规模化猪场发生了有典型症状的PR，通过4 个月的跟踪观察、实验室诊断、病毒分离和中和抗体的测定，对疾病的流行特点和防控效果进行了总结分析。

1 猪场基本情况

山西某5 000 头母猪的种猪场，母猪免疫PR C 株疫苗4 次/年，1 头份/头猪；仔猪24 h滴鼻1 头份/头猪，35 ～45 日龄免疫1 头份/头猪。 从2021 年12 月9 日开始，母猪出现流产且以妊娠中后期为主，病猪体温升高，采食量下降；产房母猪产死胎、木乃伊胎和弱子比例升高；仔猪出生后2 周内出现死亡现象，病死率达70%以上，主要表现为神经症状，头歪向一侧，共济失调，同时伴有呼吸困难。 对病死仔猪进行剖检，可见脑膜明显充血、出血，脑脊髓液增多；肺脏出血；腹股沟淋巴结肿大、出血，颜色呈紫黑色。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品 采集流产母猪血拭子4 份，流产胎儿2 头，发病仔猪的脑组织、扁桃体、肺脏、淋巴结各3 份；随机采集2021 年12 月、2022 年1 月、3 月和4 月母猪的血清共计332份；猪场使用的C 株弱毒疫苗和HB2000 弱毒疫苗各1 瓶。

2.1.2 主要试剂及仪器 核酸提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；PRV gE 基因实时荧光定量PCR 检测试剂盒、猪瘟病毒(CSF)实时荧光定量RT -PCR 检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 实时荧光定量RT -PCR 检测试剂盒购自美国IDEXX；PRV gB 和gE 抗体检测试剂盒购自美国IDEXX；DL 2000 DNA Marker 购自北京康为世纪生物科技有限公司；LA Taq、GC Buffer 购自宝生物工程(大连) 有限公司；高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、细胞消化液购自Thermo Fisher；Vero细胞由本实验室保存；PRV 阴性血清和PRV阳性血清由本实验室保存。 PCR 仪、凝胶成像系统购自Bio -Rad；荧光定量PCR 仪购自美国ABI；CO2培养箱购自SANYO。

2.2 方法

2.2.1 生产指标 2021 年12 月至2022 年4月，以月为单位记录和计算平均流产率、死胎率、木乃伊率、窝均总仔数、窝均活仔数、窝均健仔数和仔猪成活率。

2.2.2 样品处理 血拭子样品加入1 mL 灭菌生理盐水，涡旋振荡，于-80 ℃反复冻融3次，4 ℃、8 000 r/min 离心5 min，取上清进行DNA 及RNA 提取；流产胎儿及组织样品剪取约2 g 组织，按1∶5 质量比加入灭菌生理盐水，研磨成匀浆，于-80 ℃反复冻融3 次，4 ℃、8 000 r/min 离心5 min，取上清进行DNA 及RNA 提取。

2.2.3 病毒DNA 及RNA 提取 参照核酸提取试剂盒说明书进行操作。

2.2.4 实时荧光定量PCR 及RT-PCR 检测

用商品化的实时荧光定量PCR 及RT -PCR 检测试剂盒分别检测CSFV、PRRSV 和PRV。

2.2.5 引物设计与合成 根据GenBank 中PRV Ea 株(登录号: KU315430.1) gC 基因上下游保守序列设计一对特异性引物，预期PCR产物约1 748 bp，具体信息见表1，引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

2.2.6 gC 基因扩增及测序分析 取PRV 阳性病料、PRV HB2000 疫苗液、PRV C 株疫苗液提取DNA，使用gC 1F、gC 1R 引物进行PCR扩增。 PCR 扩增体系50 μL: 上下游引物各2.5 μL，LA Taq 酶0.5 μL，DNA 模板4 μL，补充无菌双蒸水至总体积50 μL。 反应条件为:95 ℃5 min，95 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃30 s，30 个循环；72 ℃延长10 min，4 ℃保存。 PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪记录结果。 将gC 基因扩增产物送到北京金唯智生物技术有限公司测序。 应用DNAman软件和MEGA 软件对测序结果进行序列比对分析，绘制遗传进化树。

2.2.7 病毒分离培养 将PRV 阳性脑组织剪碎研磨匀浆后，反复冻融3 次，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清，经0.22 μm 滤器过滤除菌。 取0.5 mL 接种长满单层Vero 细胞的25 m2底面积细胞瓶，37 ℃吸附1 h 后，弃吸附液，加入含2% FBS 的DMEM 培养液5 mL，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，逐日观察细胞病变(CPE)，待CPE 达80%左右收毒，反复冻融2 次，4 ℃、4 000 r/min 离心5 min，取上清液接种Vero 细胞进行扩大培养。

2.2.8 ELISA 抗体检测 将采集的2021 年12月、2022 年1 月和2022 年3 月共300 份血清按IDEXX 抗体检测试剂盒使用说明书检测PRV gE 和gB 抗体。

2.2.9 PRV 中和抗体测定 将免疫C 株疫苗后2 个月和免疫HB2000 疫苗后2 个月的共65份血清过滤除菌，56 ℃水浴灭活30 min 后，用无血清DMEM 将待检血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 进行稀释。 用无血清DMEM 将PRV 病毒液稀释成200 TCID50/0.1 mL，取上述不同稀释度的待检血清200 μL 分别加入等量200 TCID50/0.1 mL 的病毒液，充分混匀，37 ℃培养1 h 后接种已长成良好单层的Vero 细胞，每个稀释度接种4 孔，每孔0.1 mL，同时设正常细胞对照、不加病毒液的血清毒性对照、阳性血清对照、阴性血清对照及病毒回归对照(100 个TCID50、10 个TCID50、1 个TCID50、0.1 个TCID50)。 置37 ℃、5% CO2培养箱培养5 ～7 日，观察并记录细胞病变情况。 当正常细胞对照孔、血清毒性对照孔不出现CPE，且病毒回归试验结果符合，100 个TCID50 孔应全部出现CPE，0.1 个TCID50 应全部不出现CPE 时，实验成立。 按Reed -Muench 法计算中和效价。

3 结果与分析

3.1 生产指标

由表2 可知，2021 年12 月，猪场流产率、死胎率、木乃伊率开始升高，最高分别达到3.90%、26.13% 和8.63%，采取措施后，2022 年4 月分别低于2021 年12 月；仔猪的窝均总仔数、窝均活仔数、窝均健仔数和仔猪成活率均出现波动，先降低后升高，2022 年4 月接近或高于2021 年12 月。

表2 2021 年12 月～2022 年4 月生产性能

3.2 qPCR 检测结果

15 份样本检测PRV 核酸为阳性，检测CSFV 和PRRSV 核酸为阴性。

3.3 PRV gC 基因扩增及测序分析

对PRV 阳性样品、C 株疫苗液、HB2000疫苗液的gC 基因进行扩增，扩增片段为1 748 bp (图1)。 对测序结果进行同源性比对分析，结果显示，其与国内2012 年后流行变异毒株TJ、CD2019 和SN2018 等毒株同源性高达100%，而与国内外经典毒株如Bartha、Becker 和Kaplan及LA 毒株同源性仅为95.9%～99.3%；与市场上商品活疫苗HB2000 同源性为99.7%，与C 株疫苗同源性为95.82%(图2)。 说明此毒株为国内流行变异毒株。

图1 gC 基因PCR 扩增电泳

图2 gC 基因同源性分析

应用MEGA7.0 软件绘制遗传进化树，结果如图3 所示，PRV 毒株与国内经典强毒株Ea、Fa、2012 年之后的变异强毒株及HB2000疫苗株亲缘关系较近，处于同一分枝，而与国外经典毒株Bartha、Becker、Kaplan 及国内疫苗株C 株亲缘关系相对较远，处于不同分枝。

图3 gC 基因遗传进化分析

3.4 病毒分离培养

病料处理液接种Vero 细胞后24 h 后开始出现CPE，细胞肿胀变圆、细胞融合或拉网，48h 后成片脱落，将分离毒株命名为PRV -TZ。

3.5 ELISA 抗体检测

对gE 和gB ELISA 抗体进行分析，由表3可知，不同月份gB 抗体阳性率均为100.00%，gE 抗体阳性率随着月份及感染时间的推迟呈上升趋势，从2020 年12 月的15.00%上升到2021 年3 月的84.62%。

表3 PRV gE-ELISA 和gB-ELISA 抗体检测结果

表4 中和抗体检测结果

3.6 PRV 中和抗体测定

测定C 株疫苗免疫后2 个月和HB2000 疫苗免疫后2 个月共65 份血清的PRV 中和抗体，由表可知，使用PRV C 株疫苗免疫后2 个月即发病前，针对此毒株的母猪血清中和抗体水平较低，使用同源性较高的HB2000 疫苗免疫后2 个月，针对此毒株的gE 抗体阴性的母猪血清中和抗体水平较高，其中中和抗体1∶32 的比例达到68.75%。

4 讨论

综合猪场的发病情况、临床症状以及实时荧光定量PCR 检测结果和不同月份gE 抗体阳性率，确诊猪场感染了PRV。 PRV 可以通过直接接触、皮肤伤口或空气等途径传播。 PRV 侵入机体后先在咽黏膜和扁桃体处增殖形成原发感染灶，再通过嗅神经、三叉神经和吞咽神经的神经鞘淋巴传播至脑和脊髓，在此进行大量复制，以异染色质形式存在并形成潜伏感染[4]。 在潜伏状态下当受到外界的刺激时可被激活，并通过口、鼻或生殖道的分泌物散毒。2021 年12 月gE 抗体阳性率为15.00%，说明猪场部分猪只携带PRV，天气突然降温和连续3 天的断电刺激猪只排毒成为此次发病的诱因。

PR 目前尚无特效药，预防该病仍以疫苗免疫为主，目前商品化的疫苗主要有缺失gE基因的Bartha-k61、缺失3 个基因的HB2000和自然基因缺失的C 株疫苗。 若免疫方法和程序不合理，猪群的抗体水平不达标，猪场仍存在爆发PR 的风险。 该猪场全群免疫4 次/年PRV C 株疫苗，2021 年12 月PRV gB 抗体阳性率为100%，但猪场仍然暴发了疾病，这可能跟所使用的疫苗对此毒株交叉保护作用差有关，也可能跟免疫效果的评价方法有关。 严伟东[5]研究表明，Bartha K61 株活疫苗对传统毒株有良好保护效果，而对流行变异毒株不能提供完全保护。 马晶晶[6]攻毒试验证实，伪狂犬活疫苗C 株免疫仔猪后，80%免疫仔猪获得保护。 为了进一步研究发病原因，对从该场分离的PRV 毒株进行gC 基因片段扩增测序，比对结果表明此毒株与国内2012 年后流行变异毒株TJ、CD 2019 和SN2018 等毒株同源性高达100%，为2010 年后流行的变异PRV 毒株，与猪场所使用的PRV C 株疫苗同源性为95.8%，推测免疫C 株疫苗对该场流行的PRV 变异毒株交叉保护作用较差，无法为猪群提供完全的免疫保护。

根据报道，国内各地已先后分离到多株新流行的PRV 毒株，存在毒力增强和抗原位点发生突变的现象[7-9]。 PRV 的基因组为双股线性DNA，约150kb，可编码70 ～ 100 种蛋白质[10]。 gB 蛋白作为PRV 的主要免疫原蛋白，能诱导宿主产生中和抗体；gC 蛋白是PRV 的免疫原蛋白和主要毒力蛋白；gE 蛋白是PRV主要毒力蛋白[11]。 2011 年后分离的PRV 变异新毒株其gE 毒力基因上发生了多个位点插入或基因点突变导致毒力增强；gB 和gC 主要免疫基因与以前毒株相比发生了基因的插入或缺失以及点突变，导致产生中和抗体位点发生突变[12-16]。 中和抗体是针对完整的病毒抗原决定簇，因此，检测中和抗体可反应机体的保护作用。

测定发病前母猪血清中针对此毒株的中和抗体效价，中抗体阳性率为100%，达到1∶16的比例为36.36%，达到1 ∶32 的比例为0.00%，说明免疫C 株疫苗不能刺激机体产生针对此毒株的较高中和抗体。 替换成与该毒株同源性较高的HB2000 疫苗免疫后，再次检测gE 抗体阴性的母猪血清中和抗体，≥1∶32 的比例达到了68.75%，此时猪群生产指标恢复正常，可能使用同源性较低的疫苗毒株免疫猪群是此次猪场发病的主要原因，推断当猪群中和抗体≥1∶32 的比例达到60%以上时，可保护gE 阳性猪场的猪群不发病。 gB ELISA 抗体检测试剂盒只是检测gB 抗体，无法详细了解猪群实际的保护作用[17]，研发出与中和抗体相关性较高的检测方法对PR 免疫效果的监测有重大意义。

母猪感染PRV 后表现出不同的临床症状，妊娠前期感染返情率可高达90%[18]，中期或者后期感染可出现流产或产死胎，临产母猪感染，会因垂直传播直接引起后代仔猪患病[19，20]。 此猪场规模较大，有4 条生产线，发病期内，不同怀孕阶段母猪均出现症状，导致本场整体的流产率、死胎率和木乃伊胎率较高，断奶仔猪成活率较低，历时4 个月时间，给猪场带来了较大的经济损失，因此，研究PR 发病原因、免疫方法和评估免疫效果对PR防控具有重大意义。