抗生素类药物中基因毒性杂质检测分析进展

黄财顺,陆璐璐,冯启宏,梁小敏,潘子康,王乾蕾*

杂质是引起药品不良反应的重要因素,近几年来,国内外发生的多起重大药品安全事件无不与其密切相关[1]。而基因毒性杂质的危害更严重。基因毒性杂质(genotoxic impurity,GTI),也称遗传毒性杂质,可引起DNA突变和重组,从而导致基因癌症。由于种类繁多、毒性较大,严重性越来越受重视,风险评估和分析检测为重要手段。抗生素类药物临床用量较大,其中含有基因毒性杂质。本文对抗生素类药物中基因毒性杂质的检测与分析进行综述。

1 基因毒性杂质分类及研究概述

基因毒性杂质主要分为5大类,分别为亚硝胺类化合物、磺酸酯类化合物、肼类化合物、环氧化合物、芳香胺类化合物,多采用液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、色谱联用技术等进行检测。对无法用GC法检测到的磺酸酯类基因毒性杂质可在碱性条件下水解生成甲磺酸钠,建立合适的离子色谱法进行分析[2]。

基因毒性杂质主要产生于药物原材料合成过程中的起始物料、中间体、试剂及反应副产物。合理筛选工艺路线,识别警示结构,可从源头上遏制基因毒性杂质的产生。

2 研究进展

2.1 β-内酰胺类抗生素基因毒性杂质研究 β-内酰胺类抗生素(β-lactams)系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素,包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类及青霉烯类酶抑制剂等。

β-内酰胺类抗生素具有胺类结构,生产和存储过程中容易产生N-亚硝胺杂质,应引起足够重视。李俊等[3]建立了头孢孟多酯钠、头孢地嗪钠、盐酸头孢替安中8种N-亚硝胺类杂质的GC-MS/MS检测方法。周刚等[4]采用GC-MS/MS法,对提取溶剂进行优化,成功建立了阿莫西林原料药中12种N-亚硝胺类化合物的检测方法。蔡英杰等[5]采用振荡提取的方式,避免了基质对仪器造成的损害,成功运用GC-MS法同时检测头孢呋辛钠中的N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺。宋芸峰等[6]利用UPLC-MS/MS法同时测定13个潜在的亚硝胺类基因毒性杂质。除N-亚硝胺杂质外,β-内酰胺类药物中还可能存在氯甲烷、氯乙烷、2-巯基苯并噻唑、酰氯等基因毒性杂质,相关检测方法已建立[7-9]。

β-内酰胺类抗生素中的基因毒性杂质以N-亚硝胺类物质为主,可能为β-内酰胺中的胺类结构在合成过程中产生的副产物。由于亚硝胺类物质有着相似结构,在建立检测方法后,可同时测定多种N-亚硝胺杂质,但对仪器的灵敏度有较高要求。

2.2 酮类抗生素基因毒性杂质研究 酮类抗生素的应用较为广泛,如诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星等。此类药物合成过程中容易产生与酮类结构相近的酯类基因毒性杂质。宋太发等[10]采用分段模式检测,建立了加替沙星中基因毒性杂质对甲基苯磺酸乙酯的LC-MS/MS检测方法。范达等[11]建立了注射用甲磺酸吉米沙星中甲磺酸烷基酯类基因毒性杂质的顶空气相色谱检测方法。李霄等[12]和曹颖等[13]分别用UHPLC-HRMS和LC-MS /MS法测定了莫西沙星中的亚硝胺类化合物和酰氯类遗传毒性杂质。陈爽等[14]建立了左氧氟沙星中二氯亚砜的GC-MS检测方法。除上述喹诺酮类抗生素外,唑烷酮类也有相应研究。李倚天等[15]采用单离子扫描模式(SIM),建立UPLC-MS/MS法,可快速测定利奈唑胺中基因毒性杂质“S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐”的含量。裘亚等[16]采用LC-MS法分析发现样品中均存在潜在基因毒性杂质3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺,应予以重点关注。刘峰等[17]以UPLC-MS/MS法同时测定利奈唑胺及生产过程中产生的基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇。利奈唑胺还存在硝基苯类和S-环氧氯丙烷等基因毒性杂质[18-19]。

酮类抗生素的基因毒性杂质研究比较多,仅次于β-内酰胺类抗生素。由于碳氧双键较为活跃,在生产过程中极易转化为酯类和醇类杂质。因此,酮类抗生素的基因毒性杂质研究以甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、S-1-氨基-3-氯-2-丙醇+等物质为主,与其他类型抗生素形成鲜明对比。

2.3 氨基苷类抗生素基因毒性杂质研究 氨基苷类(aminoglycosides)抗生素是由两个或三个氨基糖分子和一个氨基环醇通过醚键连接而成。临床中常用的氨基糖苷类的抗生素包括链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星等。姚永青等[20]以5%苯甲醛甲醇溶液作为衍生化试剂,建立了硫酸阿米卡星及其制剂中基因毒性杂质肼的含量测定方法。

2.4 四环素类抗生素基因毒性杂质研究 四环素类抗生素(Tetracyclines)是结构中含并四苯基本骨架,由放线菌产生的一类广谱抗生素包括土霉素、金霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等,生产和存储过程中容易产生结构相近的杂质,如9-硝基米诺环素,属于基因毒性杂质。易芬芬等[21]采用多级反应监测(MRM)模式建立了替加环素中遗传毒性杂质9-硝基米诺环素的LC-MS检测方法。

2.5 大环内酯类抗生素基因毒性杂质研究 大环内酯类抗生素(macrolides antibiotics,MA)属于快速抑菌剂,是分子结构中具有碳内酯环的抗菌药物的总称。其作用原理是通过阻断核糖体中肽酰转移酶的活性,进而抑制细菌蛋白质的合成。其生产和存储过程中容易产生酯类杂质。张勉等[22]采用气质联用法测定克林霉素磷酸酯中的对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯。孙丽等[23]建立了阿奇霉素颗粒中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯的高效液相色谱测定方法。郝丽娟等[24]采用高效液相色谱串联质谱法检测阿奇霉素原料药及其制剂中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质。

关于氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类抗生素的基因毒性杂质研究比较少,可能与临床用量较低有关。但三类药物在治疗某些细菌感染的疾病时起着不可替代的作用,其质量安全也应引起足够重视。

3 分析与讨论

笔者等通过中国知网、万方数据及维普数据库,分别以“抗生素”“基因毒性杂质”“遗传毒性杂质”等关键词进行检索,筛选并研读相关文献,将杂质种类、检测方法及检测结果统计发现:(1)抗生素类药物基因毒性杂质研究以亚硝胺类物质为重点研究对象,约占总数的34.7%,占β-内酰胺类药物的66.6%;(2)检测方法以液相色谱及其联用方法为主,约占60%,且测定结果几乎均为“未检出”;(3)单次研究次数最多的药物为利奈唑胺,作为售价较为昂贵的药物,说明基因毒性杂质的研究偏向于价值导向型。见表1。

表1 抗生素中基因毒性杂质测定结果

β-内酰胺类抗生素中常见的基因毒性杂质为亚硝胺类物质,此类物质的产生主要有以下三点原因:(1)首先与其合成工艺密切相关。β-内酰胺类抗生素合成的关键中间体是7-ACA(7-氨基头孢烷酸)、6-APA(6-氨基青霉烷酸)、7-ADCA(7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸),在合成中容易产生具有亚硝酰自由基的氮氧化物,通过一定机理转化为仲胺,在亚硝化试剂的作用下产生亚硝胺类杂质。(2)物料污染。生产过程中可能使用N,N-二甲基甲酰胺,其中含有的微量二甲胺或二乙胺和亚硝酸盐在酸性条件下反应,产生此类杂质。(3)自身降解。某些药物本身会降解产生亚硝胺类杂质,如雷尼替丁在高温下会产生亚硝胺类杂质。

4 发展趋势及研究策略

据文献检索结果,抗生素类药物基因毒性杂质的检测结果大部分为“未检出”,但并不能排除毒性危害的存在,因为设定方法时多没有充分考虑基因毒性杂质的毒理限度。亚硝胺类杂质具有较高的致癌风险,指导原则ICH M7(R1)提出的每日1.5 μg的毒理学阈值(TTC)不太适合。药品上市许可持有人/药品生产企业应根据工艺路线、生产过程、物料属性、降解情况、分析测试结果、监管机构的要求等,确定亚硝胺类杂质的种类及限度,避免出现测定结果为“未检出”,而实际存在毒性危害的情况。

除此以外,为全面评价药物的安全性,可结合其他类型药物的杂质研究。抗生素类药物中还有一种特殊的杂质-高分子杂质,也叫高分子聚合物。在基因毒性杂质难以检测的情况下,结合高分子杂质研究,能更加准确的反映药物的质量安全信息。与基因毒性杂质不同,高聚物对照品一般难以获得,自身对照法是目前最为理想的测定方法,可结合凝胶色谱、RP-HPLC及质谱的优势制定研究策略。结合基因毒性和高分子杂质研究,具体策略见图1。