马铃薯PDS和ZDS基因的克隆与表达特性分析

石源睿 董海涛 常璐 吕运韬 贾小云 张红梅 唐锐敏

关键词：八氢番茄红素脱氢酶；ζ-胡萝卜素脱氢酶；类胡萝卜素；马铃薯；基因表达

马铃薯（SolanumtuberosumL.）是仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物，最早在南美洲安第斯地区被发现，在秘鲁被驯化，是一种与社会经济发展密切相关的优势作物[1]。其与谷类作物单位面积的可食用干物质产量几乎相同，是工业和食品加工原料的重要来源[2]。其含有丰富的类胡萝卜素，是一类高度不饱和的萜类化合物[3]，作为植物光合作用中光吸收的辅助色素，是植物光合膜的重要组成部分[4-5]。类胡萝卜素可与多种自由基发生拮抗脂质的过氧化反应[6-8]，具有延缓衰老的效果；同时还能有效防止心血管、冠状动脉粥样硬化以及血栓性等疾病的发生[9]。此外，类胡萝卜素进入人体被吸收后会转化成维生素A，以达到保护视力的效果[10]。

在植物体内，异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）经过一系列的氧化还原反应合成β-类胡萝卜素[11]。互为协同作用的八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）是类胡萝卜素合成途径中的限速酶[12]。无色的八氢番茄红素在PDS和ZDS的脱氢作用下转变为粉色的番茄红素，进而生成β-类胡萝卜素[13]，共同参与调控植物生长发育过程中类胡萝卜素的代谢途径。目前，已有许多研究表明，PDS和ZDS基因属于同源基因，在系统中可归为一类[14]。霍培等[15]、TRAVELLA等[16]研究表明，类胡萝卜在植物体内主要存在于叶绿体及许多花和植物的有色体中，与植物的光合作用及叶、花和果实的颜色形成密不可分。当植株内的PDS被沉默时，其叶片会发生白化，导致其色素含量改变，从而使其光合作用受阻。吴建设等[17]、陈段芬等[18]分别对不同生长时期的观赏性向日葵和中国水仙内的PDS表达进行研究，证实了PDS表达量的增加与花色的加深有关。在三汁蜜柚果实成熟过程中，随着果实颜色的加深，其汁胞、囊衣和海绵层中CmZDS的表达量呈现稳定上升的趋势[19]，在芒果中也有类似发现[20]。分析成熟时期番木瓜果实、叶片和花中PDS和ZDS基因的表达量发现，富含类胡萝卜素的果实中的表达量要显著高于叶片和花[21-23]。彩色马铃薯块茎中富含类胡萝卜素和花青素等次生代谢物，使其成为开发功能食品的理想资源[24]。

本研究从黄心马铃薯晋薯16号品种中分别克隆PDS和ZDS基因，利用生物信息学工具对这2个基因及其所编码的蛋白序列进行分析，并对二者在不同组织内的表达模式进行定量检测，旨在解析马铃薯PDS和ZDS在类胡萝卜素合成途径中的调控作用，为后续马铃薯品种的创新及培育奠定一定分子基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试黄心马铃薯为晋薯16号（Jinshu16），脱毒苗由山西省薯类脱毒中心提供；红心马铃薯红玫瑰2号（RedRose2）和紫心马铃薯为希森8号（Xisen8），脱毒苗均由山东省乐陵市希森薯业有限公司提供。将3个品种4周龄的组织培养苗转移至Hogellan溶液中炼苗，7d后移至基质中生长，培养于（22±1）℃、14h光照/10h黑暗条件的温室中生长，100d后收获新鲜块茎。转化所用菌株为大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α，由山西农业大学生命科学学院分子生物学实验室保存。克隆载体是PMD19-TVector。

1.2 总RNA的提取及cDNA的合成

取每个品种种植100d的马铃薯根、茎、叶和块茎各0.1g，用液氮快速冷冻后进行研磨。每个样品进行3个生物学重复。使用RNA提取试剂盒（华越洋，北京）对不同品种的马铃薯各组织总RNA进行提取。后经琼脂糖凝胶电泳对所提取RNA的完整性和质量进行检测，并根据TaKara反转录试剂盒说明书（TaKara，大连）对所提取的RNA反转录。

1.3 马铃薯StPDS和StZDS基因克隆

根据NCBI网站中查到的马铃薯StPDS和StZDS预测序列（XM_015306724.1，XM_015308927.1）设计克隆引物（表1）。

以上述反转录所得到的cDNA为模板分别对StPDS和StZDS进行PCR克隆（迈维生物，武汉），反应程序为：94℃预变性2min；94℃下变性30s，48℃（StPDS）/43.6℃（StZDS）退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸2min。扩增产物通过凝胶回收试剂盒（AxygenScientificInc.，Unioncity，USA）将目的片段回收，并与PMD19-T相连，获得重组质粒PMD19-T-StPDS和PMD19-T-StZDS。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，并将其涂布于含有氨苄霉素的LB平板培养基上过夜培养15～17h，挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆所提取的质粒（优逸兰迪，苏州）送上海生工生物公司测序，阳性克隆的菌液和所提质粒冻于-80℃保存。

1.4 马铃薯StPDS和StZDS基因的生物信息学分析

生物信息学分析软件如表2所示，分别对StPDS和StZDS转录起始位点上游1000bp的基因启动子区顺式作用元件进行预测，并对其编码蛋白的亲疏水性、理化性质、跨膜结构、信号肽、二级结构、三级结构及互作蛋白进行分析。利用马铃薯StPDS和StZDS的蛋白序列，通过BlastP在NCBI数据库中搜索其他植物PDS和ZDS的蛋白序列，使用MEGA7.0軟件，构建Neiber-Joing（NJ）系统发育树，Bootstrap分析重复数为1000。

1.5 马铃薯块茎中类胡萝卜素含量的测定

取适量的马铃薯块茎用液氮快速冷冻后研磨成粉状，称取约0.15g块茎样品置于50mL离心管中，加入15mL丙酮，于4℃黑暗处放置1～2h，直至粉末为灰白色，4000r/min离心10min，吸取上清液测定其在454nm处的吸光值。

1.6 马铃薯StPDS和StZDS基因的表达模式分析

根据马铃薯StPDS和StZDS基因序列设计特异性定量引物（表1），以晋薯16号、红玫瑰2号和希森8号的根、茎、叶和薯块的cDNA为模板，EF-1α为内参，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书（Takara，大连），通过BIO-RADCFX96荧光定量仪对马铃薯StPDS和StZDS基因进行不同品种不同组织的表达模式分析。每个样品进行3个重复。根据2-ΔΔCt法分析计算结果，并使用SPSSStatisticsv22对试验数据进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 马铃薯StPDS和StZDS基因克隆

提取晋薯16号块茎中RNA经琼脂糖凝胶电泳，对其进行检测后反转录成cDNA。以StPDSPF/PR和StZDS-PF/PR为克隆引物，PCR扩增产物如图1-A所示，在2条泳道上各得到了1条特异性条带，将这2条目的片段割胶回收、连接PMD19-T载体、转化大肠杆菌后进行菌落PCR，检测到目的片段（图1-B、C）。进一步测序结果表明，StPDS和StZDS的cDNA长度分别为1752、1767bp，与NCBI网站中预测的马铃薯PDS和ZDS基因进行比对，一致度分别为99.40%和99.35%（图1-D、E）。

2.2 马铃薯StPDS和StZDS的生物信息学分析

2.2.1 马铃薯StPDS和StZDS理化性质分析 如图2、3所示，StPDS基因编码583个氨基酸，蛋白的分子质量为64.97ku，理论等电点为6.41；StZDS基因编码588个氨基酸，分子质量约为64.73ku，理论等电点为8.51，二者均为无跨膜结构的亲水不稳定蛋白。

2.2.2 马铃薯StPDS和StZDS蛋白结构分析和信号肽预测 如图4所示，在马铃薯StPDS的二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较高，分别为38.25%和41.34%；β-片层和β-转角所占比例较少，分别为16.64%和3.77%；其三级结构预测表明，其蛋白质可能具有5个较为保守的结构域。而StZDS二级结构由40.99%的α-螺旋、16.5%的β-片层、3.57%的β-转角和38.95%的无规则卷曲构成；其三级结构预测表明，其蛋白质可能具有5个较为保守的结构域。此外，2个蛋白均无信号肽，为非分泌蛋白，这一结果也与其在细胞内发挥的功能相适应。

2.2.3 马铃薯StPDS和StZDS的启动子元件预测 利用Menu网站对StPDS及StZDS的启动子（取转录起始位点上游2000bp）进行预测，结果如图5所示，二者均具有较多的光响应元件（如TCCCmotif、TCT-motif、Box4、G-box等）和逆境有关的调控元件（如响应低温胁迫（LTR）和干旱胁迫（MBS））。其中，StPDS还具有抗氧化反应的调控元件（ARE）；对StPDS及StZDS的启动子元件预测的结果进行分析，推测马铃薯PDS及ZDS基因的表达可能受到光调节及激素和逆境的诱导与调节。

2.2.4 马铃薯StPDS和StZDS的系统进化分析在NCBI数据库中分别下载二穗短柄草（Brachypo?diumdistachyon）（XP_003558653.1）、玉米（Zeamays）（NP_001338939.1）、木薯（Manihotesculenta）（XP_021613095.1）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）（NP_193157.1）、向日葵（Helianthusannuus）（XP_022013639.1）、煙草（Nicotianatabacum）（XP_019244024.1）、辣椒（Capsicumannuum）（XP_016562403.2）、野生番茄（Solanumpennellii）（XP_027771295.1）、番茄（Solanumlycopersicum）（NP_001234095.1）共9个物种PDS的同源序列，以及番木瓜（CaricapapayaLinn）（XP_021891252.1）、小球藻（Chlorellavariabilis）（XP_005843062.1）、木薯（XP_043815084.1）、拟南芥（NP_001319473.1）、玉米（NP_001105609.2）、向日葵（XP_022010060.1）、烟草（NP_001312062.1）、辣椒（NP_001311497.1）、番茄（NP_001234383.2）共9个物种的ZDS蛋白质氨基酸序列。利用MEGA-X对上述序列进行进化树分析，结果发现（图6），马铃薯PDS及ZDS均与同为茄科植物的番茄和野生番茄的同源关系最近，推测它们可能在马铃薯内发挥着与番茄PDS、ZDS相近的功能。

2.3 马铃薯StPDS蛋白互作预测

使用String软件（https：//cn.string-db.org/）对马铃薯StPDS（Phytoenedehydrogenase）互作蛋白进行预测，结果发现（图7），StPDS与StZDS（Zeta-Carotenedesaturase）、StLYCe（Lycopeneepsiloncyclase）等酶蛋白存在互作关系。

2.4 马铃薯块茎中类胡萝卜素含量测定及StPDS和StZDS表达模式分析

对3个不同品种马铃薯叶片及块茎中类胡萝卜素的含量进行检测并分析，结果如图8所示，类胡萝卜素在红玫瑰2号叶片和块茎中含量较高，显著高于晋薯16号。

进一步利用qRT-PCR对3种不同颜色马铃薯的叶片及薯块中StPDS和StZDS基因的表达量进行检测，结果发现，这2个基因均在红心马铃薯红玫瑰2号中表达量最高，显著高于另外2个品种（P<0.05）；且在叶片中的表达量也远远高于块茎。同一组织中，类胡萝卜素含量和2个基因表达量的变化趋势一致，均表现为红玫瑰2号最高，希森8号次之，晋薯16号最低，说明StPDS和StZDS可能正向调控类胡萝卜素的积累；而在同一品种中，如红玫瑰2号，块茎中类胡萝卜素含量高于叶片，但是2个基因的表达量却表现为叶片高于块茎，这一现象说明StPDS和StZDS可能参与叶片的某些生理活动。

3 结论与讨论

类胡萝卜素是存在于许多花、果实、叶片中的天然色素。PDS和ZDS在植物体类胡萝卜素合成通路上发挥着至关重要的作用，有研究表明，这2种脱氢酶是类胡萝卜素合成通路上的重要分支点[25-27]，其表达受到抑制时会影响植物体内八氢番茄红素的积累，进而影响花、叶片和果实中类胡萝卜素含量，不仅会造成植物体种皮、果肉颜色的变化，而且还会影响植物营养物质的含量，目前已从草莓[28]、番木瓜[22-23]、水仙[20]、穿心莲[29]、甜瓜[30]等物种体内分离得到PDS或ZDS基因。

本研究成功克隆到马铃薯的PDS和ZDS，其片段大小分别为1752、1767bp，分别编码583、588个氨基酸。利用生物信息学软件对StPDS和StZDS进行理化性质和结构分析，发现二者均为无跨膜结构域的亲水性蛋白，表明二者均不是膜蛋白，这与其在植物体内发挥的功能相适应。在NCBI上搜索不同物种的PDS和ZDS序列并构建发育进化树，结果显示，马铃薯StPDS和StZDS的氨基酸序列与番茄的PDS和ZDS亲缘关系最近，表明马铃薯的PDS和ZDS可能与番茄SlPDS和SlZDS具有相似的功能和作用机制。利用String数据库对马铃薯PDS进行互作蛋白预测分析，发现StPDS蛋白与StZDS、StLYCe等酶蛋白相互作用，这一结果与KATO等[27]的研究结果一致，LCYe可以调控红色的番茄红素转变为橙色的β-胡萝卜素[21]，推测这些蛋白可能协同作用，共同正调控植物类胡萝卜素的合成。

类胡萝卜素可以吸收光作为碳同化的能源，有研究表明，PDS基因在被沉默后，植物叶片会发生白化，其光合作用受阻[16，31]。本研究对不同品种马铃薯的叶和块茎内StPDS和StZDS的基因表达量进行检测，结果显示，这2个基因均在叶片中的表达量最高，这与前人的研究结果相一致[17，28]。对马铃薯块茎类胡萝卜素含量测定发现，不同颜色薯块中类胡萝卜素的含量有所差异，其中红心马铃薯红玫瑰2号块茎中类胡萝卜素的含量最高，且红玫瑰2号中2个基因的表达量均显著高于其他2个品种，这与其块茎中类胡萝卜素含量的变化趋势相一致。对果色差异较大的3个芒果品种进行基因表达分析后也得出类似的结果，芒果PDS和ZDS基因表達量在红色芒果果皮中最高，在青色芒果果皮中最低[20]。

本研究通过克隆获得StPDS和StZDS的cDNA全长序列，并进行生物信息学分析及表达差异分析，结果表明，在同一组织中，红玫瑰2号类胡萝卜素的含量及StPDS和StZDS基因的表达量显著高于希森8号和晋薯16号，推测其可能正向调控马铃薯块茎中类胡萝卜素的积累，从而使薯块的颜色呈现红色；对不同品种的马铃薯类胡萝卜素及2个基因的表达量分析发现，StPDS和StZDS基因在叶片中的表达量远远高于块茎，这一结果与类胡萝卜素含量所呈现的趋势恰好相反。结合前人的研究，推断StPDS和StZDS可能参与叶片的光合作用。这些结果为进一步研究PDS和ZDS在马铃薯生长发育过程调控机制奠定了一定的基础，同时为改善马铃薯的外观品质提供了一定的参考依据。