畜禽粪便有机肥对黑土农田土壤抗生素抗性基因的影响

姚钦，朱玥晗，宋洁，郭永霞，2，王光华

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2.农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室；3.中国科学院东北地理与农业生态研究所）

东北黑土是我国重要的土壤资源，在维持国家粮食安全和生态安全上具有重要的地位。近年来由于生产过程中过度的开发和粗放的管理，导致土壤肥力下降，黑土退化日益严重[1-2]。目前，普遍公认有机肥添加能够有效提高黑土土壤肥力，改善黑土土壤理化性质[3-6]。然而，施用有机肥也会带来一些负面效应，其中之一就是在畜禽养殖过程中抗生素的定期使用，直接导致畜禽粪便中蕴藏了大量的抗性细菌和抗性基因[7-8]，从而最大程度驱动了农业土壤中抗性基因的积累[9]。由于抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）具有较高的移动性，它们能通过食物链的传递到达人类餐桌，进入人类体内，威胁人类身体健康，已被世界卫生组织列为21 世纪威胁公共健康的最重大挑战之一[10-11]。因此，国内外学者针对生态环境中抗生素抗性基因的积累和传播已经开展了广泛研究。

目前，在国际抗生素抗性基因数据库（Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB） 中已经包含了13 293 个基因、933 个物种和124 个属的耐药信息，其中常见的抗生素抗性基因主要有四环素类（tetracycline）、β-内酰胺类（beta Lactam）、喹诺酮类（FCA）、大环内酯类（MLSB）、磺胺类（sulfonamide）和整合子类（Integrin-integrase）6 大类[12]。研究发现四环素类是畜禽养殖过程中治疗疾病和促进生长普遍常用的抗生素，磺胺类和β-内酰胺类等其他抗生素在家禽、生猪和生牛养殖中也会大量使用，造成了畜禽粪便中不同种类的抗性基因污染[13]。另外，由于不同种类畜禽（如猪、鸡、牛）的生理生活特性和养殖习惯不同，导致使用的抗生素种类、频次及用量不同，使不同畜禽粪便中抗生素抗性基因多样性和丰度存在着显著差异[14]。有研究发现，鸡粪和猪粪中的抗生素种类和丰度远高于牛粪，主要是因为我国生产生活对鸡肉和猪肉的需求量较高，使得家禽和生猪的养殖密度大且销售期短，抗生素使用量较高，同时消化功能弱于生牛，导致家禽和生猪粪便中抗生素的残留量较高，造成ARGs 污染程度较高[13，15]。所以，农业生产中有必要探讨分析不同种类畜禽粪便有机肥施用后农田土壤中抗生素抗性基因种类及丰度差异，可以为评价畜禽粪便的生态风险提供参考。

因此，作为农业大省和畜牧业大省的黑龙江省，在关注黑土农田生态系统中施用禽畜粪便有机肥提高土壤肥力和改善黑土退化问题的同时，由其带来的抗生素抗性基因潜在危险以及对农产品和人类健康的威胁也不容忽视。为明确有机肥施用对黑土农田ARGs 的影响，研究通过荧光定量分析不同畜禽粪便有机肥对黑土农田土壤中AGRs 数量、种类和丰度的影响程度，以期为黑土农田退化管理和土壤肥力提升，以及减缓AGRs 在农黑土农田生态系统中积累策略提供理论依据，为黑土农田生产中有机肥的施用提供指导建议。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤样品采集自黑龙江省哈尔滨市双城区，该区域属于中温带大陆性季风气候，年平均气温4.4 ℃，年均降水量481 mm，土壤类型为典型黑土。

玉米收获期选择长期施用（5 年以上）有机肥的农田土壤，分别采集不同类型有机肥（牛粪N、猪粪Z和鸡粪J）施用土壤样品，同时采集施用无机肥农田土壤作为对照（CF）。土样采集深度为0～20 cm，随机多点采集玉米根围土后混匀作为一个重复样品，每个样地采集3 次重复，共12 个土壤样品。所有样品现场采集后过2 mm 土壤筛，用冰盒带回实验室用于DNA 提取。

1.2 样品DNA 提取

准确称取0.5 g 土壤样品，采用Fast DNARSpin Kit for Soil（MP Biomedicals，美国）试剂盒，按照操作说明提取农田土壤总DNA。提取完成后总DNA 用1%琼脂糖电泳检测提取结果，并使用NanoDrop 2000核酸分析仪（Thermo Scientific，美国）测定浓度及纯度。最后，DNA 保存于-20 ℃备用。

1.3 抗生素抗性基因定性检测

研究选择了6 类34 种抗生素抗性基因（ARGs），包括15 种四环素类（tetracycline）抗性基因tetA、tetB1、tetB2、tetC、tetG1、tetG2、tetL1、tetL2、tetM、tetO、tetQ、tetT、tetW、tetX1、tetX2，3 种磺胺类（sulfonamide）抗性基因sul1、sul2、sul3，4 种整合子类（Integrin-integrase）抗性基因intl1、intl2、intl3、intl4，4 种大环内脂类（MLSB） 抗性基因ermB、ermC、ermE、ermF，5 种β-内酰胺类（beta Lactam）抗性基因blaOXA-F、blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaNDM，3 种喹诺酮类（FCA）抗性基因qnrA、qnrB、qnrS。利用各抗性基因常用引物进行普通PCR 扩增[16]，定性检测不同粪便有机肥施用土壤中不同抗生素抗性基因分布情况。

1.4 抗生素抗性基因定量检测

在普通PCR 定性检测结果基础上，以细菌16S rRNA 基因作为参照标记基因，在LightCycler 480 平台（Roche Applied Science，瑞士）进行ARGs 荧光定量检测。20 μL 反应体系包含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，7 μL ddH2O，1 μL 土壤总DNA，上下游引物各1 μL。每个样本3 次重复，反应基本程序为：初变性95 ℃30 秒；变性95 ℃5 秒，退火延伸60 ℃30 秒，共40 个循环；最后冷却50 ℃30 秒。根据所得数据对ARGs 进行定量统计分析。

相对定量的统计方法如下[12]：

公式中，ARGs 是所要测定的34 种抗生素抗性基因，16S 是指待测样品的16S rRNA 基因，CT 是荧光定量所测定的循环阈值，△CT是某样品的目标基因CT值与16S rRNA 基因CT值的差值，△△CT是指待测（test）样品的目标基因△CT值与对照（control）样品的△CT值的差值，FC 值是指待测样品的目的基因相对于对照样品的富集倍数，获得的数据用于后续不同处理间抗性基因分布特征分析。

1.5 数据分析

结合抗性基因定性检测和定量检测结果，统计不同畜禽粪便有机肥施用的土壤中不同类型抗生素抗性基因检出个数、不同抗性机制的检出比例以及不同种类抗性基因的检出情况，并采用Excel 2016和SPSS 25.0 进行数据前期处理和统计学分析；采用R 语言v 3.3.1 vegan 数据包和heatmap 数据包分别进行不同有机肥处理下不同种类抗生素抗性基因分布的PCA 分析和热图分析。

2 结果与分析

2.1 施用不同有机肥对抗性基因抗性机制和种类的影响

以不同有机肥施用土壤中提取的DNA 作为模板，分别扩增四环素类（tetracycline）、β-内酰胺类（beta Lactam）、喹诺酮类（FCA）、大环内酯类（MLSB）、磺胺类（sulfonamide）、整合子类（Integrinintegrase）6 大类34 种抗性基因，施用鸡粪、猪粪、牛粪不同粪便有机肥和无机肥的土壤中分别检测到9、10、5 和9 种抗生素抗性基因。

所有土壤样品中检测到了4 种抗性机制的抗性基因，包括转座子移动原件（transposon）、细胞核糖体保护（protection）、抗生素失活（deactivate）和抗生素外排泵（efflux），各自检出个数占总检出个数的比例分别为13.33%、73.33%、6.67%和6.67%（图1 A）。由此表明，细胞核糖体保护为4 种不同施肥措施土壤中ARGs 的主要抗性机制，其次转座子移动原件，最后是抗生素失活和抗生素外排泵。将不同种类有机肥施用的土壤中抗生素抗性基因检出结果按抗性基因种类分析看出（图1 B），四环素类（tetracycline）、磺胺类（sulfonamide）、大环内酯类（MLSB）、β-内酰胺类（beat Lactam）分别占总检出个数的50%、11.54%、15.38%和11.54%，其中检出种类最多的为四环素类，其次为大环内酯类。喹诺酮类（FCA）和整合子类（Integrin-integrase）检出比例较小，合并记为other efflux，检出比例合计11.54%。

图1 不同抗性机制抗性基因检出比例（A）和不同种类抗性基因检出比例（B）Fig.1 Proportion of resistance genes with different resistance mechanisms（A）and different types of resistance genes（B）

各类抗性基因所占百分比如图2 所示，在检测的6 大类抗性基因中，施加不同类型粪便有机肥土壤中均检测到四环素类、磺胺类以及遗传元件类的抗生素抗性基因。其中，各个处理中四环素类（tetracycline）抗生素抗性基因检出比例均为最高，高达55.6%以上。施加猪粪Z、牛粪N 与无机肥CF 土壤抗性基因的分布类型基本没有区别，而施加鸡粪的土壤中（J）检测到了两大类新的抗生素抗性基因，即大环内酯类（MLSB）和β-内酰胺类（beta Lactam），并且比例和磺胺类（sulfonamide）抗性基因基本一致，约11.1%。

图2 不同类型肥料施用土壤中各类抗性基因检出比例Fig.2 The proportion of various resistance genes detected in soils applied with different fertilizers

2.2 不同施肥措施下抗生素抗性基因的分布特征

如图3 所示，施用不同畜禽粪便有机肥和无机肥土壤的抗生素抗性基因丰度和多样性均发生了明显变化。施加牛粪（N）的土壤中抗性基因类型较少，丰度较低，与施用无机肥土壤样品类似，而施用鸡粪（J）和猪粪（Z）土壤中的抗生素抗性基因的种类和丰度显著增加。其中，施用猪粪有机肥显著增加了土壤中β-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM和四环素类抗生素抗性基因tetG2丰度，四环素类抗生素tetG1和tetM丰度增加幅度较小，但也均有别于施用无机肥土壤。施用鸡粪有机肥对土壤中抗生素抗性基因类型和丰度影响最大，尤其是四环素类抗生素抗性基因tetX1的丰度显著高于所有土壤样品中检测到的其他抗性基因；其次是整合子类Integrin-integrase抗性基因intl1。并且，由热图分析发现施用鸡粪有机肥土壤中除tetX2外，检测到的其他四环素类抗性基因丰度均较高，如tetC、tetL1、tetG2、tetG1和tetM，说明施用鸡粪有机肥的土壤中四环素类抗生素抗性基因污染严重。而施用鸡粪有机肥土壤中β-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM丰度较低，与施用猪粪有机肥结果相反。总之，由抗性基因类型和丰度热图的UPGMA cluster 显示四种不同施肥制度分别形成四个簇，施用牛粪有机肥土壤和无机肥距离较近，施用鸡粪和猪粪的土壤中形成了新的抗生素抗性基因分布格局，明显区别于施用牛粪有机肥和无机肥土壤，说明施用不同粪肥有机肥明显影响了土壤中抗生素抗性基因分布特征。

图3 不同类型肥料施用土壤中ARGs 分布热图Fig 3 Heatmap of ARGs distribution in soils applied with different fertilizers

2.3 不同施肥措施下抗生素抗性基因的主成分分析

不同畜禽粪便有机肥施用土壤中抗生素抗性基因主成分分析如图4 所示，施用猪粪、鸡粪、牛粪有机肥和无机肥四个处理的土壤样品分别位于四个不同的象限，说明施加不同粪便有机肥显著改变了土壤中抗生素抗性基因的结构。主成分PC1 和PC2 分别解释了抗性基因结构变化56.6%和16.9%，施用不同粪便有机肥和无机肥的土壤样品各自的3 个重复聚集在一起，四个处理沿横轴PC1 分为四个簇，牛粪有机肥处理与无机肥处理距离较近，而施用鸡粪有机肥的样点独成一簇，与其他三个处理明显区分，同样说明抗生素抗性基因在施用猪粪、牛粪、鸡粪和无机肥土壤中存在不同的结构特征。另外，施加畜禽粪便有机肥的土壤相对于施用无机肥土壤具有更复杂的抗生素抗性基因多样性，施用牛粪有机肥样点与四环素类抗生素抗性基因tetX2结合紧密，与其他抗性基因距离较远；同样，猪粪有机肥样点与β-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM密切相关；而施用鸡粪有机肥的土壤样点与大部分丰度较高的被测抗性基因紧密结合，尤其与四环素类抗生素抗性基因tetX1密切相关，与上述热图结果基本一致，说明农业生产施加禽畜粪便有机肥显著改变了环境土壤中的抗性基因种类组成。

图4 不同类型肥料施用土壤中ARGs 主成分分析Fig.4 Principal component analysis of ARGs in soils applied with different fertilizers

3 讨论

农田生态系统中，添加有机肥能够有效提高土壤有机质含量和土壤微生物多样性，对维持农田土壤质量有着至关重要的作用[17-18]。然而，畜禽生产中抗生素的使用，增加了对农田土壤环境中微生物的选择压力，导致携带抗生素抗性基因的细菌大量出现[19-20]。因此，作为一种土壤改良措施，畜禽粪便有机肥在施用的同时也会成为ARGs 进入到农田生态系统中的主要媒介之一[7，21]。研究结果表明，施用有机肥的黑土农田土壤中ARGs 的多样性和丰度显著增加，与他人研究结果较为一致。Zheng 等[9]基于宏基因组学报道的全球首张土壤抗生素抗性基因空间与丰度分布图研究结果显示全球农业土壤的ARGs 丰度显著高于非农业土壤，并且畜禽养殖是最主要的驱动因素。这可能是由于有机肥的添加，一方面引入大量ARGs 的同时，也增加了土壤有机碳的含量，促进了土壤中耐药菌和有机肥携带耐药菌的生长繁殖[22]，也有可能是有机肥中的抗性细菌迁移定殖到土壤中，抗性基因通过水平转运作用机制转移到土壤微生物中[23]，导致有机肥施用后土壤中AGRs 多样性和丰度的提高。

有机肥施用土壤中抗生素抗性基因的丰度和多样性也会因畜禽种类的不同而存在差异[14]。研究中不同畜禽粪便有机肥施用形成了不同的抗生素抗性基因分布格局，由AGRs 分布热图看出，施用鸡粪的土壤中AGRs 丰度和种类高于施用猪粪的土壤样品，而施用牛粪有机肥的土壤样品中抗性基因积累最少。这可能与不同畜禽动物的生活习性和养殖习惯有关，一方面，相对于生牛养殖，鸡和猪的养殖密度大，出栏期短，养殖过程中需要频繁使用抗生素（如多肽类的杆菌肽锌、恩拉霉素；多粘菌素类的硫酸粘杆菌素）来防治疾病和促进生长，导致鸡粪和猪粪中抗生素残留量大，施入土壤中后AGRs 种类多且丰度相对较高[15，24]。另一方面，生猪和家禽养殖多采用圈养方式，动物流动性较差，封闭式环境不利于堆积粪便中抗生素的降解，且它们的消化功能差，导致生猪和家禽粪便有机肥中抗生素抗性基因积累较多[14]。此外，除了不同粪便有机肥土壤样品间抗性基因特征存在差异之外，研究还发现施用无机肥的土壤中也检测到一定数量的抗生素抗性基因，并且AGRs 多样性分布特征类似于施用牛粪有机肥土壤样品，这一结果与他人研究报道基本相符。Su 等[25]在未施粪肥和堆肥的水稻土样品中检测到了丰度较低的抗性基因，说明土壤本身是一个丰富的抗性基因储藏库，在未受畜禽粪便污染的土壤环境中也能检测到具有内在抗性的抗生素抗性基因。

畜禽养殖业中四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类和整合子类是主要的抗生素类型。研究发现所有土壤样品中均检测到高达55%的四环素类抗生素抗性基因，并且检出的抗性基因种类也较多，由热图也看出丰度较高且变化明显的大部分抗性基因属于四环素类，这与他人研究结果一致[26]，主要原因可能是因为四环素类抗生素是畜禽养殖业中使用量最大的一类抗生素，并且它们容易被吸附在土壤颗粒上造成在土壤中残留积累。对于AGRs 的传播来说，虽然在自然条件下本来就存在少量的AGRs，但是人类活动仍然被认识是AGRs 的主要传播方式[27]。ARGs 的水平传播方式下，主要是借助整合子、转座子、基金盒、质粒和噬菌体等可移动遗传元件（Mobile genetic elements，MGEs）的水平转移机制，通过接合、转化、转导等过程来实现ARGs 在不同微生物之间的水平传递[28-29]。研究结果显示，长期施用鸡粪的农田土壤（J）中转座子类（intl1）数量显著高于检测到的其他抗生素抗性基因（P＜0.05），说明长期施加鸡粪可以增加土壤中转座子水平遗传元件的富集倍数，容易造成周边土壤进行抗生素抗性基因水平传播。这种基因的水平传播，可能对施用有机肥后土壤中的抗生素浓度以及对土壤中耐药菌的生长速度和衰亡速度都存在影响[30-31]。同时，土壤中抗生素抗性基因的水平转移对于ARGs 在微生物间的传递起着重要作用，也是导致农田土壤中ARGs 丰度改变的关键因素[32]。

东北黑土区是我国重要的粮食生产基地，有机肥施用是黑土区土壤肥力提升，缓解黑土退化常用的有效措施。但有机肥中禽畜粪便是农田土壤中抗生素抗性基因的重要来源，由于其对抗生素和耐药菌的引入，给人类和动物带来的健康安全问题不容忽视。研究初步明确了有机肥施用对黑土农田土壤抗生素抗性基因的影响，鸡粪、牛粪和猪粪均能明显增加土壤中抗生素抗性基因，尤其施用鸡粪有机肥带来的污染威胁最严重。今后在黑土农田有机肥施用过程中，要充分考虑农田土壤中施用不同种类有机肥导致ARGs 积累的影响因素，可以通过堆肥、日晒或高温处理等方法降低有机肥中抗生素和抗性基因的数量和丰度。未来针对黑土农田由于有机肥施用导致的抗生素及ARGs 的影响机制，以及根据目前东北黑土农田抗生素抗性基因的污染现状及调控措施和ARGs 消减技术的应用开发也有待进一步研究。

4 结论

（1）研究施用不同粪肥的所有土壤中主要的抗性基因为四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类和磺胺类，其中四环素类检出率最高（55%以上）。

（2）农业生产施用畜禽粪便有机肥明显增加了土壤中抗性基因的种类和丰度，并且显著改变了土壤中抗生素抗性基因的结构，施用鸡粪有机肥污染风险更大。