木霉菌配施有机肥对甜瓜果实糖及代谢酶活性的影响

李春霞，聂佳慧，陈钱广，高佳怡，肖漫，王雨舒，熊亚男，靳亚忠

（黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，大庆 163319）

甜瓜以含丰富的维生素B、维生素C、胡萝卜素、柠檬酸等营养物质和口感甜脆在水果界享誉盛名，深受广大消费者青睐[1]。在经济利益的驱使下，设施甜瓜种植模式单一，农药化肥的大量使用，造成土壤连作障碍与可续发展农业发展矛盾突出[2]，导致甜瓜产量和品质明显下降。有研究表明，有机肥可以促进作物对营养的吸收，改善果实的品质，如苹果、柠檬上均有报道[3-4]。因此，合理配施有机肥，减少化肥施用量，提高甜瓜产量和品质，缓解土壤连作障碍，已成为设施甜瓜生产中亟待解决的重要问题。

国内外研究表明，适当减少氮肥施入量能有效提高番茄、葡萄和辣椒等果蔬产量、可溶性糖和维生素C 含量[5-6]；在减少化肥施用的同时配施有机肥可提升园艺作物的品质，在冬枣[7]、蓝莓[8]、葡萄[9]、芒果[10]等作物中均有报道；施用木霉菌会促进植株体内物质的代谢，提高甜瓜抗性和品质[11]。但目前对有机肥与木霉菌配施提高甜瓜果实品质的研究还鲜见报道。因此，研究通过减施化肥配施有机肥和木霉菌，以甜瓜生长发育过程中糖分积累及蔗糖代谢关键酶活性的动态指标变化为依据，明确减施化肥配施有机肥和木霉菌对甜瓜品质的影响，也为木霉菌在生产上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甜瓜品种：薄皮甜瓜“CH7”（花后28～30 d成熟），为黑龙江八一农垦大学园艺园林学院设施课题组提供的自交系。供试常规肥料：主要有商品有机肥、商品复合肥、磷酸二铵和硫酸钾肥，均来自黑龙江田力保生物科技有限公司，其中各肥料氮磷钾含量占比见表1。供试木霉菌：木霉菌菌剂为棘孢木霉菌，有效孢子量≥109CFU·g-1，由黑龙江八一农垦大学园艺园林学院和黑龙江田力保生物科技有限公司共同研制而成。供试土壤类型为黑钙土，其基本理化性质为：氨态氮含量为40.88 mg·kg-1，速效磷含量为76 mg·kg-1，速效钾含量为140 mg·kg-1，pH 值为7.8。

表1 不同供试肥料中氮磷钾含量占比Table 1 Ration of nitrogen，phosphorus and potassium content in different tested fertilizers

1.2 试验设计

试验中共设有5 个处理，以不施肥和常规施用化学肥料为对照组，设置农民常规施肥、有机肥全部替代化肥和半量替代化肥，同时配施木霉菌剂为处理组。各处理肥料施用量见表2。木霉菌施用量为30 kg·hm-2，分别在甜瓜植株定植和甜瓜定果期施用，具体做法是把50 g 木霉菌溶解在25 L 水中，平均施在小区内每个甜瓜的根部。甜瓜在四叶一心期定植，每个小区种植6 行，每行8 株，3 次重复，小区面积约为30 m2。甜瓜按期进行浇水，整枝打叉，采用吊蔓栽培，子蔓结瓜，每株保留第8、9、10 节位的子蔓用于结瓜。在花后第21（成熟前期）、28（成熟期）和35 d（成熟后期）收集甜瓜果实，采取果实赤道部位的果肉，每个样品2 g，将果实样本用锡箔纸包装后迅速放入液氮进行冷冻，置于-40 ℃冰箱中保存，用于果实含糖量及代谢相关酶指标的测定。

表2 各处理肥料施用量Table 2 Fertilizer application amount of different treatments

1.3 测定指标与方法

1.3.1 糖含量的测定

可溶性糖：蔥酮试剂法[12]测定。取0.5 g 甜瓜果肉放入试管中，加入10 mL 蒸馏水后封口，沸水浴30 min，提取液过滤后定容至50 mL。吸取l mL 提取液和l mL 蒸馏水于试管中，加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL 浓硫酸，充分振荡后沸水浴l min 后取出，自然冷却，以空白作参比，630 nm 测定吸光度。

果糖、葡萄糖、蔗糖含量的测定：参照杨乐[13]的方法。称取2 g 甜瓜果肉于液氮条件下研磨，加入5 mL 80%乙醇溶液，80 ℃水浴30 min，冷却后3 000 g条件下离心10 min，取上清液定容至50 mL，以备果糖、葡萄糖和蔗糖的测定，采用蒽酮-硫酸比色法测定。

1.3.2 酶活性的测定

取1 g 甜瓜果肉于研钵中，加入少量的石英砂和10 mL HEPES 缓冲液，冰浴研磨成匀浆，4 ℃12 000 g离心20 min，收集上清液。上清液逐渐加硫酸铵至80%溶解度，冰上放置15 min，4 ℃12 000 g 离心30 min，弃上清液，用提取缓冲液3 mL 溶解沉淀，转移到透析袋中，置于4 ℃冰箱中，20 小时后取出即为酶提取液。果实糖代谢相关酶活性的测定方法〔酸性转化酶（AI），中性转化酶（NI），蔗糖合成酶分解方向酶（SS-d），蔗糖磷酸合成酶（SPS），蔗糖合成酶合成方向酶（SS-s）〕，参照李合生[14]的方法。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 23.0（ANOVA）进行数据处理与统计分析，利用origin 9.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 甜瓜果实生长发育过程中糖分积累的动态变化

2.1.1 化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施对甜瓜果实可溶性糖含量的影响

由图1 可以看出，随着甜瓜果实生长发育，果实中可溶性糖含量呈现上升的趋势，且在同一时期，各处理的甜瓜果实可溶性糖含量之间存在明显差异。在甜瓜果实发育的各个时期，各处理的甜瓜果实可溶性糖含量显著高于CK（P＜0.05），而化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施处理的甜瓜果实可溶性糖含量则显著高于CK1 处理，且T3 处理甜瓜果实中可溶性糖含量始终高于T2 和T1 处理（P＜0.05）。

图1 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实可溶性糖含量的影响Fig.1 Effects of different fertilization treatments on soluble sugar content of muskmelon fruits

2.1.2 化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施对甜瓜果实果糖、葡萄糖、蔗糖的影响

图2 结果表明，随着果实发育，果糖含量呈升高趋势，且在甜瓜果实生长发育的各个阶段，各处理甜瓜果实中的果糖含量变化不尽相同。在花后21 d 的薄皮甜瓜果实中，CK1 处理的甜瓜果实中果糖含量最高，显著高于其它处理，而T1 和T2 处理之间无明显差异，但果实的果糖含量显著低于T3 处理（P＜0.05）。在花后28 d 时，T3 处理的甜瓜果实果糖含量最高，显著高于其它处理，而T1 和T2 处理之间无明显差异，但显著低于CK1 和CK 处理（P＜0.05）。在花后35 d 时，T2 和T3 处理的甜瓜果实果糖的含量显著高于CK1、CK 和T1 处理（P＜0.05），而T1 处理果糖含量最低，显著低于CK 和CK1 处理，但T2和T3 处理之间无明显差异（P＜0.05）。

图2 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实果糖含量的影响Fig.2 Effects of different fertilization treatments on fructose content of muskmelon fruits

由图3 可以看出，随着薄皮甜瓜果实生长发育，果实中葡萄糖含量呈现逐渐升高的趋势，在同一时期，各处理之间甜瓜果实葡萄糖含量存在明显差异。在花后21 d 时，CK 甜瓜果实中葡萄糖含量最高，显著高于其它处理，CK1、T1 和T2 处理间无差异，而T3 处理的葡萄糖含量最低，显著低于其它处理（P＜0.05）；在花后28 d 时，T3 处理的甜瓜果实葡萄糖含量最高，显著高于其它处理，与CK 相比，CK1、T1和T2 处理甜瓜果实葡萄糖含量显著下降（P＜0.05）；在花后35 d 时，与CK 和CK1 处理相比，化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施处理（T1、T2 和T3）的甜瓜果实中葡萄糖含量显著升高，CK1 和CK 处理之间无显著性差异（P＜0.05），且T3 处理果实中葡萄糖含量最高，达6.61 mg·g-1。

图3 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实葡萄糖含量的影响Fig.3 Effects of different fertilization treatments on glucose content of muskmelon fruits

图4表明，随着甜瓜果实生长的发育，果实中蔗糖含量呈逐渐升高的趋势；在花后21 d 的薄皮甜瓜果实中，T1 处理的甜瓜果实蔗糖含量最高，显著高于其它处理，T3 处理的甜瓜果实中蔗糖含量最低，显著低于其它处理，CK1、T1 和T2 处理的蔗糖含量显著高于CK（P＜0.05）；在花后28 d 时，与CK 和CK1 相比，T1、T2 和T3 处理的蔗糖含量显著升高，且T3 处理蔗糖的含量最高，高达2.98 mg·g-1，而CK1 中果实蔗糖含量则显著低于CK 处理（P＜0.05）；在花后35 d时，与CK 相比较，各施肥处理果实蔗糖含量显著升高，且T1、T2 和T3 处理果实的蔗糖含量显著高于CK1处理，且T3 处理果实蔗糖含量最高，达4.04 mg·g-1。

图4 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实蔗糖含量的影响Fig.4 Effects of different fertilization treatments on sucrose content of muskmelon fruits

2.2 甜瓜果实生长发育过程中糖代谢相关酶活性的动态变化

2.2.1 化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施对果实蔗糖合成酶活性的影响

由图5 可以看出，随着甜瓜果实生长发育，果实中蔗糖合成酶-合成方向的酶活性（SS-s）存在显著差异，呈现逐渐增长趋势。在花后21 d，与CK 相比，各处理的甜瓜果实SS-s 酶活性显著提高，且T1、T2和T3 处理SS-s 酶活性明显高于CK1 处理，T2 处理酶活性最高（P＜0.05）；在花后28 d 时，与CK 和CK1处理相比较，T1、T2 和T3 处理SS-s 酶活性显著升高，T2 和T3 处理显著高于T1，但二者之间无差异，CK 与CK1 处理间则无差异（P＜0.05）。在花后35 d，各处理间SS-s 酶活性无显著性差异（P＜0.05）。

图5 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实蔗糖合成酶（合成方向）活性的影响Fig.5 Effects of different fertilization treatments on sucrose synthase activity（synthesis direction）in muskmelon fruits

从图6 可以看出，随着甜瓜果实生长发育，果实中蔗糖合成酶-分解方向酶活性（SS-d）呈现逐渐下降的趋势。在花后21 d 时，T1 处SS-d 酶活性显著高于其它处理，而CK1、T2 和T3 处理之间无明显差异，但显著高于CK（P＜0.05）；在花后28 d 时，CK 处理SS-d 酶活性显著高于其它处理，CK1、T2 和T3 处理之间无明显差异，且低于T1 处理（P＜0.05）；在花后35 d，各处理间SS-d 酶活性无显著性差异（P＜0.05）。

图6 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实蔗糖合成酶（分解方向）活性的影响Fig.6 Effects of different fertilization treatments on sucrose synthase activity（decomposition direction）of muskmelon fruits

2.2.2 化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施对果实蔗糖磷酸合成酶活性的影响

从图7 中可以看出，在甜瓜果实生长发育的不同时期，各处理的甜瓜果实中蔗糖磷酸合成酶活性（SPS）存在明显差异。在花后21 d 时，与CK1 和CK处理相比，各处理的甜瓜果实SPS 酶活性显著升高，而T1 与T3 处理间无明显差异，但都高于T2 处理，CK处理SPS 酶活性最低（P＜0.05）；在花后28 d 时，与CK 相比，T1 和T2 处理SPS 酶活性显著升高，CK1处理的酶活性显著下降，T3 则无显著差异（P＜0.05）；在花后35 d 时，与CK 和CK1 处理相比较，T1、T2 及T3 处理SPS 酶活性显著升高，而T1 和T3 处理之间无明显差异（P＜0.05）。

图7 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶活性的影响Fig.7 Effects of different fertilization treatments on sucrose phosphate synthase activity of muskmelon fruits

2.2.3 化肥减施与有机肥及木霉菌剂配施对果实酸性和中性转化酶活性的影响

由图8 可以看出，随着甜瓜果实生长发育，甜瓜果实中酸性转化酶活性（AI）呈现逐渐下降趋势，且在同一时期，各处理之间AI 活性差异明显。在花后21 d 时，T3 和CK1 处理的果实的AI 活性显著高于CK 和T1、T2 处理，且T3 处理酶活性最大，而CK 和T1 处理之间无明显差异，但明显高于T2 处理（P＜0.05）；在花后28 d 时，T1 处理AI 活性显著高于其它处理，CK1、T2 与T3 处理之间无明显差异，且显著低于CK 处理（P＜0.05）；在花后35 d 时，CK1 处理AI活性显著高于其它处理，CK、T1 与T3 处理之间无明显差异，且低于T2 处理（P＜0.05）。

图8 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实酸性转化酶的影响Fig.8 Effects of different fertilization treatments on acid invertase of muskmelon fruits

图9表明，随着薄皮甜瓜果实生长发育，甜瓜果实中中性转化酶活性（NI）呈现逐渐下降的趋势，且在同一时期，各处理NI 活性存在明显的差异。在花后21 d 时，与CK 相比，CK1、T1，T3 处理NI 活性显著升高，T2 无显著差异；T3 处理显著高于CK1 和T1，CK1 与T1 处理之间无明显差异（P＜0.05）。在花后28 d 时，T2 处理NI 活性显著高于其它处理，且T1 与T3 处理之间无明显差异，但显著高于CK 和CK1 处理（P＜0.05）。在花后35 d 时，与CK、CK1 相比，T2 和T3 处理NI 活性显著升高，而T1 处理无明显差异（P＜0.05）。

图9 不同施肥处理对薄皮甜瓜果实中性转化酶的影响Fig.9 Effects of different fertilization treatments on neutral invertase in muskmelon fruits

3 结论与讨论

甜瓜因其口感清脆，香甜可口而被广大消费者所青睐。香甜是衡量甜瓜品质的重要指标，果实中糖分的含量及其组成种类是影响果实品质的重要因素之一[15]。研究发现，随着甜瓜果实生育期的增长，甜瓜果实中可溶性糖、葡萄糖、果糖和蔗糖含量逐渐增加，尤其在花后35 d 达到最高，而且各处理的可溶性糖、果糖、葡萄糖和蔗糖的糖含量在花后28 d 和35 d积累较多，这可能与研究中所用的甜瓜品种有关，“CH7”品种在花后28～30 d 内成熟。研究发现，配施木霉菌后，农民常规施用化肥+木霉菌（T1）较农民常规施用化肥处理（CK1）显著增加了甜瓜各个时期的可溶性糖、葡萄糖和蔗糖含量，可能是由于木霉菌通过调控根系分泌物和土壤微生物的多样性来提高植株的可溶性含糖量，这与前人的研究结果一致[16]。有机肥配施木霉菌（T2）和减施化肥配施木霉菌和有机肥处理（T3）各个时期的可溶性糖、葡萄糖和蔗糖的含量显著高于CK1 和T1 处理，说明木霉菌和有机肥是改善甜瓜品质的有效途经之一，这与前人在其它作物上研究结果一致[17-18]，尤其减施化肥配施有机肥和木霉菌效果更显著，说明减施化肥条件下配施木霉菌和有机肥是提高甜瓜品质，促进甜瓜可持续发展的有效手段之一。

国内外研究表明，植物果实中糖分的变化与蔗糖代谢的关键酶活性有关[19-20]，主要包括蔗糖合成酶（合成与分解两方向）、蔗糖磷酸合成酶和转化酶（酸性转化酶和中性转化酶）[17]。研究发现各处理甜瓜果实的蔗糖、葡萄糖和可溶性总糖含量随着生育期的生长而增长，SS-s 和SPS 酶活性相应随之升高，而AI 和NI 随着蔗糖含量的增加而降低，这与刁倩楠[21]对甜瓜的研究结果一致。大量的试验结果表明，配施有机肥是改善土壤环境，提高作物品质和产量的有效手段[22-23]。在研究中，配施木霉菌和有机肥的T1、T2和T3 处理都显著增加了果实可溶性糖和蔗糖的含量，同时提高了果实成熟前期的SS-s 和SPS 活性，降低了果实成熟后期的SS-d、AI 和NI 酶活性，这与前人在甜菜和梨中的研究结果相类似[24-25]。但是甜瓜果实中果糖含量较低且AI 和NI 活性逐渐下降，这与枸杞研究结果正好相反[26]，可能的原因是甜瓜果实以蔗糖为主，而枸杞则以果糖和葡萄糖为主，主要是因为它们的发挥合成和积累的酶之间的协调关系可能存在差异。大量的研究提出配施有机肥和木霉菌可以通过土壤微生物多样性的调控、根际有益微生物的定殖以及激素信号的传导等方式调控植物-微生物互作以及植株体内糖的积累与运输以改变源-库关系，进而影响植物体内的糖代谢[27-28]，从而导致各类糖组成和含量的差异，达到调控果实品质的目的。木霉菌和有机肥配施调控甜瓜糖代谢的微生物学和分子生物学机理还不清楚，需要进一步分析研究。

综上所述，与CK（不施肥处理）和CK1（农民常规施肥）相比较，配合施用木霉菌或者木霉菌-化肥-有机肥配施（T1、T2、T3）处理通过促进果实中SS-S酶、SPS 酶和成熟前期NI 酶的活性，抑制成熟和成熟后期甜瓜果实的SS-d 酶和AI 酶的活性，从而不同程度地提高了薄皮甜瓜果实中可溶性糖含量以及成熟果实中果糖、葡萄糖、蔗糖含量，尤其是T3 处理效果明显。因此，减施化肥配施木霉菌和有机肥，通过调节糖代谢酶之间的协调性，进而促进成熟果实糖分合成和积累，从而达到提升甜瓜品质和减肥的目的。