基于UFLC-QTRAP-MS/MS技术分析三叶崖爬藤不同部位的多元活性成分

陈海杰,周永逸,薛 佳,邹立思*,吴 楠,袁嘉欢,刘训红,2,程建明,2

1南京中医药大学药学院;2江苏省经典名方工程研究中心,南京 210023

三叶青为葡萄科崖爬藤属三叶崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg(THDG)的块根或全草[1,2],药用历史悠久,属“新浙八味”之一,具有清热解毒,活血祛风等功效,主要用于高热惊厥,肺炎,哮喘,肝炎,风湿,瘰疬,跌打损伤[3]。现代药理研究表明三叶青具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、解热、镇痛、免疫调节等药理作用[4-6]。

三叶崖爬藤主要生长于长江以南地区[2],在浙江民间地区有较久的药用历史,其全草及块根皆可使用,而近些年有研究发现其不同药用部位在化学成分、药理活性等方面,存在明显的差异性,如地上部分提取物的抗氧化活性显著高于地下部分提取物,而地下部分提取物的羟基自由基清除活性显著高于地上部分[7]。由于三叶青目前只收录于地方中药标准规范[8],其指标成分并未明确规定,且随着近些年研究表明除黄酮[9-10]、酚酸[11]、多酚[12]、多糖[13]等为三叶青主要的活性成分外,鞣质、氨基酸及核苷等成分也有潜在的生理活性。其中原花青素B2等鞣质成分具有抑制胃癌发生的作用[14],氨基酸类成分对肝损伤具有较好的疗效[15],而核苷类成分具有良好的抗菌抗病毒作用[16]。目前,对于三叶崖爬藤不同部位活性成分的研究主要集中于总黄酮[17]、总酚酸[11]、总多糖[18],较少有同时对多种活性成分类别进行含量测定,且其不同部位质量评估与控制方面的分析方法主要是高效液相色谱法[19]、气相色谱质谱联用法[20]和液质联用技术[21]等。因此为了给三叶崖爬藤不同部位的质量控制及资源合理应用提供参考数据,有必要建立一种快速测定其不同部位活性成分含量并进行质量评估的方法。

超快速高效液相色谱-三重四极线性离子阱质谱联用技术(UFLC-QTRAP-MS/MS)具有高分离度、高选择性、高灵敏度,能够对混合化合物进行快速分离鉴别,适合于三叶青多组分复杂体系的分离分析。因此,本研究以三叶崖爬藤的块根、茎、叶为实验对象,通过UFLC-QTRAP-MS/MS技术同时测定60种活性成分,采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘回归分析法(PLS-DA)、方差分析法等多元统计分析方法来区分和揭示不同部位之间的活性成分差异,并应用灰色关联度分析法(GRA)对不同部位进行质量评估。本研究结果可为三叶崖爬藤不同药用部位多种活性成分的快速定量及质量控制提供方法参考,并为其资源的合理开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

没食子酸(批号:110831-200302)、槲皮苷(批号:111538-200302)、尿苷(批号:887-200202)、槲皮素(批号:100081-200406)、表儿茶素(批号:10878-200102)、山柰酚(批号:110861-200303)、苏氨酸(批号:140682-201302)、丝氨酸(批号:140688-201803)、谷氨酸(批号:140690-201604)、缬氨酸(批号:140681-201703)、金丝桃苷(批号:111521-201406)、脯氨酸(批号:140677-201808)、腺苷(批号:110879-201703)、咖啡酸(批号:110885-201703)、异亮氨酸(批号:140683-201302)、鸟苷(批号:111977-201501)、亮氨酸(批号:140687-201905)、牡荆素(批号:111687-202105)、苯丙氨酸(批号:140676-201706)、异鼠李素(批号:110860-201611)购自中国食品药品检定研究院;次黄嘌呤(批号:1400661-hypoxanthine)、组氨酸(批号:O60M821V)、甘氨酸(批号:SM15GA14)、丙氨酸(批号:S20A6G17672)、天冬氨酸(批号:BCBG3906V)、胞苷(批号:100982718)、尿嘧啶(批号:TM0313XB13)、2′-脱氧腺苷(批号:XM0516GA14)、酪氨酸(批号:SM0503GE13)、2′-脱氧鸟苷(批号:N07A7W12580)、2′-脱氧肌苷(批号:WN1119 HB14)、肌苷(批号:TJ0623XA13)、原儿茶酸(批号:H21J9Z64031)、木犀草素(批号:C24M8Q36543)、胸苷(批号:1001182663)、儿茶素(批号:P21J11F 118380)、虎杖苷(批号:ZM0530LA14)、白藜芦醇(批号:YM0509YA14)、芹菜素(批号:T30A11 F112008)购自上海源叶生物科技有限公司;原儿茶醛(批号:101204)购自上海融禾医药科技有限公司;芦丁(批号:0080-9705)购自中国生物制品检定所;异槲皮苷(批号:C21H20012)购自江苏永健医药科技有限公司;荭草苷(批号:RDD-H04402 201005)、表没食子儿茶素(批号:RDD-B0211 1812016)、异荭草苷(批号:RDD-Y13211903019)购自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司;原花青素B2(批号:DSTDY005001)、原花青素B1(批号:DSTDY005101)、异牡荆素(批号:DSTDY005401)、紫云英苷(批号:DSTDZ000101)、烟花苷(批号:DST200619-075)购自成都德斯特生物技术有限公司;隐绿原酸(批号:12112605)、新绿原酸(批号:12112712)购自成都普瑞法科技开发有限公司;白皮杉醇(批号:AF21101758)、牡荆素鼠李糖苷(批号:AF20091006)、香橙素(批号:AF21052108)、水仙苷(批号:AF21061303)、阿福豆苷(批号:AF20121404)购自成都埃法生物科技有限公司;半胱氨酸(批号:20161127)、赖氨酸(批号:20161122)、绿原酸(批号:20160701)购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。以上化合物纯度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯)购自德国Merck公司;乙醇(分析纯)购自南京化学试剂股份有限公司;实验用水为 Milli-Q超纯水。

三叶崖爬藤各部位样品于2022年1月7日采自浙江省台州市黄岩区(北纬32°3′52.74",东经118°48′8.71"),均为三年生,经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的块根、茎、叶(见图1)。凭证标本存放在南京中医药大学中药鉴定实验室,详细信息见表1。

表1 三叶崖爬藤不同部位样品信息Table 1 Sample information of different parts of THDG

图1 三叶崖爬藤全株及不同部位Fig.1 Whole plant and different parts of THDG

1.2 仪器与设备

DHG-9410A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);KQ-500B超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司,超声功率500 W,40 kHz);Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司);湘仪H1650-W高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);SIL-20A XR超快速液相色谱仪,包括LC-20AD二元输液泵、CTO-20AC柱温箱、STL-20A XR自动进样器(日本岛津公司);AB QTRAP 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪,配有Analyst 1.6.3软件和电喷雾离子源(美国AB SCIEX公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为XBridge®C18色谱柱(4.6 mm× 100 mm,3.5 μm);以水(含0.4%甲酸)流动相A,以甲醇为流动相B;梯度洗脱程序:0～4 min,7%→9% B;4～6 min,9%→21% B;6～10 min,21%→35% B;10～12 min,35%→38% B,12～16 min,38%→46% B;16～20 min,46%→64% B;20～21 min,64%→7% B;柱温30 ℃;流速0.8 mL/min;进样量2 μL。图2为60种化合物的MRM图,图3为混合对照品的TIC图,图4为供试品的TIC图。

图2 60种成分的MRM图Fig.2 Multi-reaction monitoring (MRM) of 60 constituents

图3 混合对照品总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of the mixed control

图4 供试品总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of the sample

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI);喷雾电压(IS):离子源温度(TEM):550 ℃;多反应监测离子扫描模式(MRM)检测,各化合物去簇电压(declustering potential,DP)及碰撞能量(collision energy,CE)见表2;正离子模式为4 500 V、负离子模式为-4 500 V;雾化气(GS1):55 psi;气帘气(CUR):40 psi;辅助气(GS2):55 psi;接口加热,全程通入氮气。各化合物的最佳质谱参数见表2。

表2 60种化合物的质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters of 60 constituents

1.3.3 对照品溶液制备

分别称取赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、胞苷、尿嘧啶、缬氨酸、次黄嘌呤、尿苷、腺苷、2′-脱氧腺苷、酪氨酸、鸟苷、肌苷、没食子酸、2′-脱氧鸟苷、异亮氨酸、2′-脱氧肌苷、亮氨酸、胸苷、原儿茶酸、苯丙氨酸、新绿原酸、原花青素B2、原儿茶醛、表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B1、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、虎杖苷、荭草苷、异荭草苷、白皮杉醇、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素、金丝桃苷、香橙素、芦丁、异槲皮苷、白藜芦醇、槲皮苷、紫云英苷、烟花苷、水仙苷、阿福豆苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、异鼠李素对照品适量,精密称定,置10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液溶解制成质量浓度分别为1.008、1.000、1.160、1.180、1.100、1.180、1.160、0.960、1.024、1.046、0.962、1.010、1.010、0.998、1.064、0.784、0.970、1.000、0.990、1.104、0.970、1.016、1.070、1.078、1.012、1.014、1.164、1.036、0.960、1.096、1.154、1.034、1.044、1.075、0.984、0.662、1.052、1.034、1.062、1.034、1.168、0.996、1.118、1.056、0.994、0.936、0.970、1.020、1.094、1.036、1.032、1.004、0.992、0.982、0.866、1.032、1.128、0.320、1.064、1.062 mg/ml的对照品母液。分别取各对照品母液适量,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇定容,制成混合对照品溶液,逐级稀释,得一系列不同浓度的混合对照品溶液,置5 ℃冰箱密封保存。

1.3.4 供试品溶液制备

精密称定约0.5 g样品粉末(过65目筛),置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入60%乙醇12.5 mL,密闭,称定,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)50 min,放冷,用60%乙醇补足减失重,摇匀,滤过,滤液以12 000 r/min离心10 min,取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

1.3.5 方法学考察

1.3.5.1 标准曲线、检测限和定量限

精密吸取“1.3.3”项下一系列浓度的对照品溶液及混合对照品溶液各2 μL,按“1.3.1”和“1.3.2”项色谱、质谱条件进样分析。以对照品的质量浓度(X,ng/mL)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,进行线性回归获得回归方程、线性范围和相关系数(r)。分别以信噪比S/N≈ 3和S/N≈ 10时各对照品的质量浓度作为检测限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。60种目标成分在一定质量浓度范围内均呈良好的线性关系,r值均大于0.998 9,结果见表3。

表3 60种化合物的线性考察结果、检测限及定量限Table 3 Linear test results,limits of detection,limits of quantification of 60 constituents

1.3.5.2 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验

精密吸取同一混合对照品溶液2 μL,在同一天内连续6次进样分析,计算获得60种目标成分峰面积的日内精密度相对标准偏差(RSD)为0.94%～4.98%;每天进样3针,连续3天进样分析,计算得日间精密度的RSD为0.89%～4.98%,表明仪器具有良好的精密度;取同一三叶青样品6份,精密称定每份为0.5 g,分别按“1.3.4”项方法制备供试品溶液,进样分析,计算得60种目标成分含量的RSD为1.00%～4.98%,表明该方法具有较高的重复性;取同一三叶青供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h时进样分析,计算得60种目标成分峰面积的RSD为0.81%～5.45%,稳定性考察结果如表4所示。精密称定9份三叶青样品粉末0.5 g,分别加入“1.3.3”中低、中、高3个水平(80%、100%、120%)的混合对照品溶液,每个水平3份。将供试品与对照品溶液置50 mL具塞锥形瓶中,精密加入60%乙醇至12.5 mL,按“1.3.4”项方法制备加样回收供试品溶液,并按“1.3.1”和“1.3.2”色谱及质谱条件进样测定,计算各成分的平均回收率和RSD值。得到60种目标成分的平均回收率为96.1%～101.76%,RSD <4.87%,表明该方法的准确度良好,结果见表4。

表4 60种化合物的精密度、重复性、稳定性、加样回收率Table 4 Precision,repeatability,stability,and recovery of 60 constituents

1.3.6 样品含量测定

取供试品溶液注入液相色谱-质谱联用仪,按照上述色谱-质谱条件测定,并做方法学考察,用外标法计算各样品中目标成分的含量。

1.3.7 多元统计分析

根据60种目标成分的含量,用主成分分析、偏最小二乘判别分析、方差分析和灰色关联度分析对三叶崖爬藤块根、茎、叶进行分析与评价。使用Analyst 1.6.3工作站进行原始数据处理。将含量结果导入SIMCA-P 13.0进行分析,通过主成分分析初步观察各样品的聚集情况,再以偏最小二乘回归分析法分别对各样品进行分类,根据变量权重值(VIP >1)找到部分潜在的差异化学成分。运用SPSS Statistics 22.0进行单因素方差分析,筛选具有显著性差异(P<0.05)的成分。灰色关联度分析则由Excel表格进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

为了获取最佳的色谱条件,比较XBridge®C18柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm)和Agilent ZORBAXSB-C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)对60种活性成分的分离效果,前者分离度和灵敏度较高,故选择XBridge®C18柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm)。分别考察了不同有机相(甲醇、乙腈)以及不同比例(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%)甲酸的水相,结果表明,当甲醇-0.4%甲酸水作流动相时,各成分能够获得较好的峰形,响应值较高,因此本实验选用甲醇-0.4%甲酸水为流动相。

2.2 质谱条件的优化

为了获得最佳的质谱条件,将60种活性成分在正离子和负离子模式下进行全扫描。结果显示,氨基酸与核苷在正离子模式下有较高响应值,酚酸、鞣质和多酚化合物在负离子模式下响应更强。黄酮中除了荭草苷和异荭草苷在正离子模式下响应较高,其他成分在负离子模式下响应较佳。因此,本实验同时选用正负离子两种模式测定60种化合物的含量。

2.3 供试品制备方法的优化

以乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)为考察因素,确定各因素适宜水平,以获得最佳提取条件。结果表明,乙醇浓度、料液比和提取时间对提取物浓度影响较大。当乙醇浓度为60%,提取时间为50 min,料液比为1∶25进行超声提取时,提取效果最好。

2.4 样品含量结果

三叶崖爬藤不同部位六类活性成分含量测定结果见图5、表5。从活性成分总含量角度分析,叶、茎、块根分别达到了14 263、11 583、4 603 μg/g,表明不同部位中活性成分的积累规律为叶>茎>块根。从各类成分的角度分析,图5柱状图中的氨基酸、黄酮、酚酸、核苷四类成分在块根、茎、叶中都呈低到高的趋势,而鞣质、多酚化合物则在茎中含量最高。图5饼图中显示,黄酮成分在不同部位中占比为叶>茎>块根,表明三叶崖爬藤不同部位黄酮类成分的含量有明显差异。此外,酚酸类成分在叶中占比达到了15.82%,显著高于其他部位,而氨基酸在块根与叶中占比均达到50%以上。综上可表明不同部位间活性成分的积累有一定差异。

表5 三叶崖爬藤不同部位中六类成分含量Table 5 Content of six types of constituents in different parts of

图5 三叶崖爬藤不同部位的六类成分含量柱状图与饼图Fig.5 Histogram and pie chart of the content of six types of constituents in different parts of THDG

2.5 多元统计分析

2.5.1 主成分分析(PCA)

PCA分析可以将变量降维转化为不相关的变量,对较多因素影响的数据分析能作出更合理的判断。本实验采用PCA对三叶崖爬藤不同部位样品的数据进行分析(见图6)。其中R2X = 0.966,Q2= 0.859表示模型成立可靠、预测率高。图6显示三叶崖爬藤不同部位在PCA模型中达到较好的分类效果,说明三者之间的多元活性成分存在差异。叶和块根、茎距离较远,说明叶和其他部位在多元活性成分上有明显差异。

图6 三叶崖爬藤不同部位的PCA分析Fig.6 PCA analysis of different parts of THDG

2.5.2 偏最小二乘回归分析法与方差分析

为了进一步筛选对不同部位质量产生影响贡献较大的成分,采用SMICA-P 13.0软件分别对18批三叶崖爬藤不同部位的活性成分含量进行PLS-DA分析,图7为PLS-DA分析与VIP得分图,其中(R2X = 0.938,Q2= 0.982),表示模型成立可靠,预测性高。图7显示,三组样品在PLS-DA模型中都达到良好的分类效果,样品叶位于PC1轴左边,而样品块根与茎位于PC1轴右边,说明叶与其他两组差异较大,块根与茎在活性成分上具有一定相似性。通过VIP得分图可分析对三组分类贡献较大的成分(VIP >1),共筛选得到12个活性成分。

图7 不同部位的PLS-DA分析与VIP得分图Fig.7 Plot of PLS-DA analysis and VIP score for different parts注:VIP图中横坐标数字对应表2成分。Note:Horizontal numbers in the VIP diagram correspond to constituents in Table 2.

由于这12个化合物在不同部位中的具有一定的丰度变化,本研究运用SPSS Statistics 22.0对12个活性成分进行最小显著性差异(LSD)检验(假设方差相等)或Tamhane′s T2检验(假设不存在方差相等)。如图8,其中有8个成分在块根、茎、叶三个部位中的含量存在显著性差异。这些差异成分主要是黄酮类与氨基酸类,分别为牡荆素、异牡荆素、荭草苷、异荭草苷、原花青素B2、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸,这些化合物可作为区分三叶崖爬藤不同部位的活性成分标志物。

图8 三叶青不同部位中12种化合物的方差分析Fig.8 Variance analysis of 12 compounds in different parts of THDG注:T、S、L分别代表块根、茎、叶;*P <0.05;**P <0.01;***P <0.005。Note:T:Tubers,S:Stems,L:Leaves;*P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.005.

2.5.3 灰色关联度分析

灰色关联度分析(GRA)是灰色系统理论中的一种影响度量方法,它分析给定系统中一个主要因素和所有其他因素之间的不确定关系。根据60种生物活性成分的含量,对三叶崖爬藤不同部位进行GRA综合评价。GRA结果包括灰色综合评价值(相对关联度,ri)和质量等级排序如表6所示。相对关联度表示组分含量与样品之间的相对关联关系,ri值越高表示样本质量越好。从表中排序来看,各部位样品较为集中,叶(S7～S12)排序靠前,茎(S13～S18)和根(S1～S6)其次,说明叶部位的品质相对其他两部位较优。此外,S10与S6的ri差异值达到了49%,也从侧面表明三叶崖爬藤不同部位间品质差异较大。

表6 不同部位的灰色关联度分析Table 6 Gray correlation analysis of different parts

3 讨论与结论

研究结果表明,三叶崖爬藤块根、茎、叶间质量差异明显,部分成分的含量存在显著性差异。通过PLS-DA、VIP值与方差分析筛选出8种化合物可作为区分不同部位的活性成分标志物,其中牡荆素、异牡荆素、荭草苷、异荭草苷在叶、茎、块根中含量均呈高到低趋势,且皆为黄酮碳苷类化合物。由于黄酮碳苷类成分有极强的DPPH自由基清除能力[22],因此本实验结果也可为三叶崖爬藤地上部分抗氧化活性高于地下部分的结论提供数据依据[7]。此外,原花青素B2在茎中含量高达5 029.22 μg/g,与块根、叶分别相差4倍、15倍之多,且其具有明显的抗氧化、抗肿瘤等活性,表明原花青素类成分可能在不同部位的代谢活动中起到重要的作用。灰色关联度分析中相对关联度(ri)值可对块根、茎、叶样品进行质量等级排序,而最终结果显示叶部位样品(S7～S12)排序靠前,表明其质量优于茎与块根部位。

综上所述,本研究建立了超快速高效液相色谱-三重四极线性离子阱质谱联用技术(UFLC-QTRAP-MS/MS)同时测定三叶崖爬藤不同部位中的60种活性成分的方法,并结合多元统计分析对不同部位进行比较和评价。含量测定结果表明各部位活性成分种类丰富,其中叶部位中的多元活性成分总含量高于茎与块根。此外,主成分分析等多元统计分析表明三叶崖爬藤不同部位活性成分差异明显,并揭示了8种显著性差异成分,分别为牡荆素、异牡荆素、荭草苷、异荭草苷、原花青素B2、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。灰色关联度分析表明叶部位的品质相对较优,茎与块根其次。本研究结果为三叶崖爬藤不同部位活性成分的测定及质量控制提供了方法参考,并为其资源的合理开发利用奠定基础。