山楂叶总黄酮对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性及相关基因表达的影响

陈薇伊,徐兴军,刘佳人,张伟伟,杨 烨,邵淑丽

齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室寒区麻及制品教育部工程中心,齐齐哈尔 161006

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,其患病率在全球逐年增长,现已成为第四位需要优先考虑的疾病[1-3]。血糖浓度过高会引起机体代谢紊乱,导致组织损伤和功能障碍[4]。这种疾病最常见的形式是1型和2型糖尿病[5],这两种类型的特征是由于胰岛素产生不足(1型)[6]或细胞对胰岛素敏感性的丧失而导致的高血糖被称为胰岛素抵抗(2型),虽然这两种糖尿病类型都有不同的病因,但它们都受到细胞氧化应激的影响。1型糖尿病发病的核心机制是遗传、环境、免疫因素交互作用导致的胰岛β细胞特异性损伤,造成胰岛素绝对不足[7,8],目前治疗该病的药物主要是胰岛素,但由于胰岛素特殊的给药方式影响了患者的依从性和其自身的治疗效果,包括低血糖事件、体重增加以及酮症酸中毒等副作用,因此寻求胰岛素外的药物帮助1型糖尿病患者控制血糖具有重要的临床意义。

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)既可食用又可作为药用,山楂叶具有降血脂、降糖、降血压等多种药理活性,同时还具备抗氧化的作用。山楂叶中富含多种生物活性成分,Li等[9]研究表明,山楂叶中的多糖类化合物具有清除DPPH和OH自由基的能力。Hu等[10]研究表明,山楂叶黄酮可通过上调LDLR的表达,促进清除高脂血症小鼠肝脏中游离的胆固醇,从而改善小鼠脂质代谢紊乱。Zhang等[11]研究表明,脊髓损伤大鼠通过腹腔注射山楂叶总黄酮可抑制细胞凋亡,促进运动功能恢复。Li等[12]研究表明,山楂叶总黄酮可显著提升非酒精性脂肪肝病肝细胞中超氧化物歧化酶(speroxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)水平,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,提升机体抗氧化能力,从而延缓或阻止非酒精性脂肪肝病的进展。

本试验首先通过注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建糖尿病小鼠模型,再将山楂叶黄酮(total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL)按照不同浓度灌胃建模成功的糖尿病小鼠,探究山楂叶黄酮对糖尿病小鼠的抗氧化作用,为山楂的开发利用以及糖尿病的预防和治疗提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要药物

研究对象购自吉林长春亿斯实验动物技术有限责任公司,合格证号:SCXK(吉) -2020-00 01。为84只4周龄SPF级雄性ICR小鼠(22.00±2.00)g,并在齐齐哈尔大学生命学院动物生理学实验室进行了为期1周的适应性饲养。山楂叶黄酮购自成都埃法生物科技有限公司,纯度90%。本实验经过齐齐哈尔大学动物伦理委员会批准实施,伦理审批号:QiqiharUEC20220507。

1.2 糖尿病模型的制备

实验室适应性饲养1周后,测定小鼠血糖及体质量,按组间体质量差异不显著(P>0.05)随机选12只为空白对照组(control group,Con),其余72只均为模型组。各模型组小鼠一次性按150 mg/kg腹腔注射浓度为1%的链脲佐菌素,构建STZ诱导的糖尿病小鼠模型,空白对照组注射等量的配置链脲佐菌素溶液所使用的溶剂—柠檬酸钠。注射前禁食12 h,注射后可自由饮食、饮水,注射72 h后测定小鼠空腹血糖浓度。小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L,并表现出明显的多饮、多食、多尿症状,造模成功。

1.3 动物分组与给药方法

选取造模成功的小鼠72只,随机分为120 mg/(kg·d)的山楂叶黄酮高浓度组(high dose of total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL-H)、60 mg/(kg·d)的山楂叶黄酮中浓度组(medium dose of total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL-M)、30 mg/(kg·d)的山楂叶黄酮低浓度组(low dose of total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL-L)、阳性对照组(positive control group,Pos)、模型组(model control group,Mod)和DMSO模型对照组(DMSO model control group,DMSO),每组数量为12只,空白组和模型组灌胃蒸馏水,阳性对照组灌胃300 mg/(kg·d)的盐酸二甲双胍。各组小鼠自然光照,饮食、饮水,于室温下每天定时灌胃4周。

1.4 小鼠血糖及口服糖耐量的测定

利用血糖仪(GA-3型)测定小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)浓度,采用剪尾取血法,将得到的血液滴到载玻片上并用血糖仪进行测量,操作前后均进行消毒。测定小鼠空腹血糖(0 min)后,小鼠按2 g/kg灌胃葡萄糖,进行尾尖采血,以血糖仪检测糖灌胃后15、30、60、120 min 的血糖值为口服糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)。

1.5 抗氧化酶活性测定

最后一次灌胃后,小鼠禁食24 h,并通过断颈法处死小鼠。将血液离心以制备血清。肝脏在低温条件下解剖,用预先冷却的生理盐水清洗,并在-80 ℃下保存在冰箱中供日后使用。用试剂盒法测定T-AOC、SOD、GSH-PX酶活性和MDA含量。

1.6 抗氧化酶相关基因表达测定

根据小鼠SOD-1(NM_011434.2)、SOD-2(NM_013671.3)、GPX-1(NM_008160.6)、GPX-4(NM_008162.4)和GAPDH(NM_001289726.1)的基因序列设计引物,序列如表1所示。从小鼠肝脏样本中提取总RNA,使用Prime ScriptTM RT试剂盒将总RNA反转录到cDNA中,使用逆转录合成的cDNA作为模板,内部参照GAPDH,并使用2-△△Ct该方法计算基因的相对表达。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.7 数据处理

2 结果与分析

2.1 山楂叶黄酮对STZ诱导的糖尿病小鼠血糖及口服糖耐量的影响

由表2可知,试验期间,空白对照组小鼠血糖呈动态平衡,DMSO对照组和水模型对照组小鼠血糖浓度持续上升,各黄酮试验组和阳性对照组总体呈下降趋势。试验结束后,各黄酮试验组组小鼠血糖显著低于DMSO模型对照组(P<0.05),低酮组极显著低于DMSO模型对照组和水模型对照组(P<0.01),并且与阳性对照组相比组间差异不显著(P>0.05)。山楂叶黄酮可以降低糖尿病小鼠血糖浓度。

表2 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠空腹血糖值的影响Table 2 Effect of different concentrations of TFHL on fasting blood glucose in diabetic

由表3可知,空白对照组、阳性对照组及中酮组均在15 min时有葡萄糖峰值,此时空白对照组血糖浓度为15.00±1.92 mmol/L,阳性对照组血糖浓度为20.13±1.88 mmol/L,中酮组血糖浓度为22.90±1.07 mmol/L。高酮组和低酮组在30分钟时有葡萄糖峰值,此时高酮组血糖浓度为21.87±0.32 mmol/L,低酮组血糖浓度为19.50±0.57 mmol/L。DMSO模型对照组和水模型对照组在60分钟时有葡萄糖峰值,此时DMSO模型对照组血糖浓度为27.40±0.46 mmol/L,水模型对照组血糖浓度为26.37±0.48 mmol/L。山楂叶黄酮可以改善糖尿病小鼠葡萄糖峰值时间。

表3 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响Table 3 Effect of different concentrations of TFHL on OGTT in diabetic

2.2 山楂叶黄酮对STZ诱导的糖尿病小鼠胰岛素变化的影响

由图1可知,空白对照组小鼠胰岛素含量最高,水模型和DSMO对照组小鼠胰岛素含量最低,各试验组及阳性对照组胰岛素含量由大到小依次为阳性对照组、低酮组、高酮组、中酮组。其中DMSO对照组与水模型对照组比组间差异不显著(P>0.05);水模型对照组与高酮组、中酮组、低酮组相比组间差异均极显著(P<0.01)。山楂叶黄酮可增加糖尿病小鼠体内胰岛素含量。

图1 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠胰岛素变化的影响Fig.1 The effect of different concentrations of TFHL on insulin changes in diabetic

2.3 山楂叶黄酮对STZ诱导的糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影响

由表4可知,小鼠血清中,DMSO模型对照组和水模型对照组的T-AOC、SOD、GSH-PX酶活性以及MDA含量差异不显著(P>0.05);水模型对照组T-AOC、SOD及GSH-PX酶活性极显著低于各黄酮实验组(P<0.01);水模型对照组MDA含量极显著高于各黄酮实验组(P<0.01)。山楂叶黄酮可提高糖尿病小鼠血清中T-AOC、GSH-PX以及SOD酶活性,降低MDA含量。

表4 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影响Table 4 Effect of different concentrations of TFHL on SOD,T-AOC,GSH-PX and MDA in serum of diabetic

2.4 山楂叶黄酮对STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影响

由表5可知,小鼠肝脏中,DMSO模型对照组和水模型对照组SOD酶活性显著低于各黄酮实验组(P<0.05),而MDA含量极显著高于各黄酮实验组(P<0.01);各黄酮实验组T-AOC和GSH-PX酶活性极显著高于DMSO模型对照组和水模型对照组(P<0.01)。山楂叶黄酮可提高糖尿病小鼠肝脏中T-AOC、GSH-PX以及SOD酶活性,降低MDA含量。

表5 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠肝脏中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影响Table 5 Effect of different concentrations of TFHL on SOD,T-AOC,GSH-PX and MDA in the liver of diabetic

2.5 山楂叶黄酮对STZ诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化基因相对表达量的影响结果

由图2、3可知,小鼠肝脏中各黄酮实验组SOD-1、SOD-2、GPX-1、GPX-4基因的表达量均极显著高于DMSO模型对照组和水模型对照组(P<0.01),其中各黄酮实验组GPX-4基因表达量与阳性对照组相比差异不显著(P>0.05)。糖尿病小鼠经山楂叶黄酮灌胃4周后,肝脏中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4四种抗氧化基因的表达量均有极显著提升。

图2 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠SOD-1基因(A)和SOD-2基因(B)表达的影响Fig.2 Effect of different concentrations of TFHL on SOD-1 gene (A) and SOD-2 (B) gene expression in diabetic

图3 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠GPX-1基因(A)和GPX-4基因(B)表达的影响Fig.3 Effect of different concentrations of TFHL on GPX-1 gene (A) and GPX-4 gene (B)

3 讨论及结论

血糖是身体细胞、组织、器官重要的能量来源[13]。口服糖耐量试验能够对机体胰岛β细胞功能、糖代谢状况进行评估[14]。Huang等[15]研究表明,鱼腥草总黄酮能降低1型糖尿病小鼠的血糖。上述研究表明黄酮类化合物对糖尿病的治疗有积极作用。本试验结果显示,山楂叶黄酮可降低糖尿病小鼠血糖浓度并改善葡萄糖峰值时间,与上述研究结果相一致。胰岛素是体内唯一降糖激素[16],通过其含量可判断糖尿病病变程度。本试验结果显示,山楂叶黄酮可增加小鼠体内胰岛素含量,降低糖尿病小鼠血糖浓度,这与Zeng等[17]研究桑叶黄酮可显著降低糖尿病小鼠血糖水平,改善其糖代谢的结果相一致。在本试验结果中,低剂量山楂叶黄酮降低血糖的效果最好,这可能是由于低剂量山楂叶黄酮会首先作用于胰腺,促进胰岛素的分泌进而使血糖降低,而高剂量山楂叶黄酮会首先作用于肝脏,修复肝脏的损伤,使相应的基因表达增强。这与Zhang[18]、Lu[19]等的研究结果一致。

目前研究显示,糖尿病发病机制复杂,其重要的发病机制为活性氧自由基积累使机体抗氧化能力下降[20,21]。Liu等[22]研究表明,准噶尔山楂叶中三种黄酮成分均有清除自由基的功能;根据本次实验,由各组数据显示,发现山楂叶黄酮能显著提高血清和肝脏中抗氧化酶活性,并使MDA含量降低,可能有以下几个方面的原因,一是由于半琨式自由基其性质较稳定,而在体内的自由基能与山楂叶黄酮中的酚羟基发生反应,生成稳定的半琨式自由基,从而终止了自由基链式反应,链式反应终止使机体抗氧化能力提高。二是MDA的含量可以因为脂质过氧化反应而增加,机体过量的自由基会导致此反应产生。山楂叶黄酮可以抑制脂质过氧化,血清和肝脏中MDA含量不会因此增加,机体抗氧化能力也就随之增强。三是山楂叶黄酮中黄酮种类较多,当B环存在邻羟基时,2,3位双键对B环失去电子后自旋产生稳定的自由基,4位羰基能和邻羟基生成氢键,使得自由基中间体更加平稳。此外,在细胞中存在Fenton反应(Fe2++H2O2→Fe3++·OH+·OH-),牡荆素可与Fe2+发生络合反应,络合位点在4-羰基-5-羟基之间,络合Fe2+可有效减少·OH的生成,形成络合物沉淀,减少自由基,提高机体抗氧化能力。山楂叶黄酮可提高1型糖尿病小鼠肝脏和血清中抗氧化酶的活性,降低MDA含量,使机体抗氧化能力得到增强。抗氧化基因的表达与抗氧化酶的抗氧化作用密切相关。

当机体氧化程度超出氧化物清除能力,氧化和抗氧化系统稳定性被破坏,造成氧化损伤[23]。低水平氧化应激状态下机体的抗氧化蛋白在抗氧化反应元件(antioxidant-response element,ARE)或亲电反应元件(electrophilic response element,EpRE)的顺式作用元件介导下被激活[24]。ARE可从转录水平上调控抗氧化酶对机体氧化应激状态下的反应[25]。正常生理情况下,核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(epoxy chloropropane kelch sample related protein-1,Keap1)相结合于胞浆中,活性被抑制,在泛素蛋白酶作用下降解,以保持在生理状态下Nrf2的低转录活性[26],当细胞处于氧化应激状态下时,原本相结合的Nrf2与Keap1解偶联,活化了的Nrf2进入细胞核后与小Maf蛋白形成二聚体,进而识别并结合ARE元件,启动下游基因转录,机体抗氧化酶的转录活性因此被提高,故而平衡机体氧化损伤[27]。

在本试验中,糖尿病小鼠经山楂叶黄酮灌胃4 w后,肝脏中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4四种抗氧化基因的表达量均有极显著提升,其原因可能有两方面,一方面可能由于糖尿病小鼠体内氧化应激较为严重,使得机体抗氧化系统无法平衡自由基进攻,从而造成细胞的严重氧化损伤并且机体内源性抗氧化系统无法消除自由基,山楂叶黄酮不但可消除体内自由基,亦可与金属离子发生络合作用,减少自由基和金属离子对细胞的氧化损伤,促进Nrf2的核内转位,增加Nrf2的表达,进而增加糖尿病小鼠肝脏中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4基因的表达量。另一方面可能由于糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性降低,导致体内自由基增加,造成细胞氧化损伤,引起线粒体系统供能不足以及DNA、RNA转录受阻,使患病小鼠肝脏中抗氧化基因的表达量极显著降低。由于山楂叶黄酮均有清除体内自由基的作用,灌胃后,小鼠细胞中DNA、RNA转录得到改善,使糖尿病小鼠肝脏中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4基因的表达量得到提高。Deng等[28]研究表明,槲皮素可激活乙醇孵育的人原代肝细胞中Nrf2的核转位表达。Ganesan[29]、Zhang[30]等的研究表明,牡荆素通过激活β细胞调节凋亡的关键蛋白,包括NF-κB和Nrf2,从而改善胰岛素分泌。均与本试验结果相一致。

结果表明,山楂叶黄酮可使MDA含量极显著降低,并极显著提高STZ诱导的糖尿病小鼠血清和肝脏中T-AOC、SOD以及GSH-PX酶活性。山楂叶黄酮可显著上调STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏中SOD-1、SOD-2、GPX-1、GPX-4基因的表达量。综上所述,山楂叶黄酮可改善糖尿病氧化损伤,具有良好的抗氧化作用,在对于糖尿病的治疗与相关药物研发上具有良好的发展前景。