贝达喹啉联合吡嗪酰胺对耐多药肺结核患者的影响*

周静 曾忠 赖海斌

耐多药肺结核是通过呼吸道传播的结核病，属于耐药结核病的一种，是临床的常见病、多发病，是目前引起死亡的主要传染病[1]。它属于难治性肺结核，主要是指结核分枝杆菌感染患者对常用抗结核药物异烟肼和利福平的耐药性。在现今研究阶段中，我国结核病及耐多药肺结核发病情况较为恶劣，总发病人数已经达到了全球总患者的1/4，成为世界第22 个结核病高负担国家。耐多药肺结核治疗有效率较低，复发率、死亡率较高，且治疗费用高[2-3]。结核病的发生对人们生命健康造成了极大的威胁，且由于治疗不当或经济困难，耐药结核病患者数量逐年增加[4]。目前，结核病的治疗多采用抗结核药物，然而，耐多药肺结核的高传染性和高空洞形成率，传统药物难以有效控制病情，实现有效治疗[5]。本文旨在探究贝达喹啉联合吡嗪酰胺对耐多药肺结核患者微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）、微小RNA-223（microRNA-223，miR-223）表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年4 月—2021 年4 月赣州市第五人民医院收治的耐多药肺结核患者232 例，按照随机数字表法将患者分为吡嗪酰胺组和联合治疗组，各116 例。纳入标准：符合文献[6]《肺结核基层诊疗指南（2018 年）》中的诊断标准。排除标准：有心肝肾等机体重要脏器严重受损；对本次研究药物过敏；有肺炎、肺癌等疾病；合并肺外结核；有严重的精神疾病。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者、家属均知情同意。

1.2 方法

吡嗪酰胺组根据患者药敏试验结果选择吡嗪酰胺（生产厂家：沈阳红旗制药有限公司，批准文号：国药准字H21022354，规格：0.25 g）口服治疗，每次0.75 g，2 次/d，连续24 周。联合治疗组在吡嗪酰胺组的基础上采用贝达喹啉 片（生 产 厂 家：Recipharm Pharmaservices Private Limited，批准文号：国药准字HJ20171366，规格：100 mg）治疗，前2 周剂量为400 mg，1 次/d，2 周后更改剂量为200 mg，3 次/周，连续使用24 周。

1.3 观察指标与评价标准

1.3.1 miR-155、miR-223 表达量检测 采用RT-PCR法检测miR-155、miR-223 表达量，取两组外周静脉血3 mL，分离出单个核细胞，提取单个核细胞总RNA采用Trizol 法，检测RNA 含量、纯度，使用Takara 逆转录试剂盒行逆转录处理后得到cDNA，设计引物序列采用Primer5.0 软件，以U6 为内参，U6 引物上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，引物下游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，miR-155 引 物上 游：5'-GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'，引物下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，miR-223 引物上游：5'-GGGGGTGTCAGTGTCAAAT-3'，引物下游：5'-CAGTGCAGGGTCCCGAGGTAT-3'。PCR 反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 次循环；72 ℃ 10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳30 min，拍照分析光密度值，计算miR-155、miR-223 相对表达量。

1.3.2 腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）、C反应蛋白（C reactive protein，CRP）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、丙氨酸氨基转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（aspartic transaminase，AST）、总蛋白（total protein，TP）水平检测 采用酶联免疫 吸 附 试 验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测，抽取所有患者治疗前1 d 及治疗后1 d 清晨空腹静脉血3 mL，分离血清，-80 ℃保存。使用稀释液对血清进行稀释。其次，在反应孔内将稀释好的55 μL 标准品加入其试管内，随后将其置于室内常温环境中进行30 min 的孵育。再次，采用相关洗涤液洗涤，洗涤次数为3 次，待洗涤3 次结束后，将相关抗体工作液（55 μL）加入，加入后放置于常温中进行10 min 孵育。最后，洗涤3 次，加入115 μL 终止液终止反应，450 nm 波长测量每孔 吸 光 度，查 出ADA、CRP、IL-6、IL-2、ALP、ALT、AST、TP 水平。

1.3.3 第1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 s，FEV1）、FEV1/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）%、每分钟最大通气量（maximum ventilation volume，MVV）水平检测 两组患者治疗前1 d 及治疗后1 d 采用德国耶格公司Masterscreen Pneumo肺功能仪检测相关指标。

1.3.4 临床疗效 显效：临床症状基本消失，经X 线检查结果显示病灶吸收，空洞闭合；有效：临床症状有所改善，经X 线检查结果显示病灶无明显变化；无效：未达到上述标准。显效+有效=总有效。

1.3.5 不良反应 对两组患者治疗过程中肝损伤、恶心呕吐、神经系统症状、腹泻腹胀等不良反应发生情况进行统计。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般资料比较

吡嗪酰胺组：男68 例，女48 例，年龄31～49 岁，平均（38.00±6.55）岁，病程1～3 年，平均（1.90±0.95）年；联合治疗组：男72 例，女44 例，年龄31～48 岁，平均（38.18±6.92）岁，病程1～3 年，平均（1.91±0.88）年。两组患者上述性别、年龄、病程比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 两组miR-155、miR-223 表达量比较

两组治疗前miR-155、miR-223 表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后miR-155、miR-223 表达量均明显降低，且与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组miR-155、miR-223 表达量均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组miR-155、miR-223表达量比较（±s）

*与本组治疗前相比，P＜0.05。

组别 miR-223 miR-155治疗前 治疗后 治疗前 治疗后吡嗪酰胺组（n=116）16.24±5.14 14.55±4.15* 823.26±152.36 662.36±142.58*联合治疗组（n=116）16.22±5.12 4.21±1.36* 823.24±152.34 415.59±126.54*t 值 0.030 25.500 0.001 13.940 P 值 0.976 0.001 0.999 0.001

2.3 两组ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平比较

两组治疗前1 d ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后1 d ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平均明显降低，且与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组ADA、CRP、IL-6、IL-2 水平均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组ADA、CRP、IL-6、IL-2水平比较（±s）

表2 两组ADA、CRP、IL-6、IL-2水平比较（±s）

*与本组治疗前1 d 相比，P＜0.05。

组别 ADA（U/L）CRP（mg/L）治疗前1 d 治疗后1 d 治疗前1 d 治疗后1 d吡嗪酰胺组（n=116）39.42±12.36 31.62±10.21* 41.69±11.24 31.26±10.24*联合治疗组（n=116）39.40±12.34 22.69±6.41* 41.67±11.22 18.65±5.14*t 值 0.012 7.978 0.014 11.854 P 值 0.990 0.001 0.989 0.001组别 IL-6（ng/L）IL-2（ng/L）治疗前1 d 治疗后1 d 治疗前1 d 治疗后1 d吡嗪酰胺组（n=116）57.62±15.62 46.52±12.25* 56.36±15.24 48.52±12.69*联合治疗组（n=116）57.60±15.60 29.42±9.14* 56.34±15.22 34.52±11.24*t 值 0.010 12.050 0.010 8.895 P 值 0.992 0.001 0.992 0.001

2.4 两组ALT、TP、ALP、AST 水平比较

两组治疗前1 d ALT、TP、ALP、AST 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后1 d ALT、ALP、AST 水平均明显降低，TP 水平均明显升高，且与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组ALT、ALP、AST 水平均明显降低，TP 水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组ALT、TP、ALP、AST水平比较（±s）

表3 两组ALT、TP、ALP、AST水平比较（±s）

*与本组治疗前1 d 相比，P＜0.05。

组别 ALT（U/L）TP（g/L）治疗前1 d 治疗后1 d 治疗前1 d 治疗后1 d吡嗪酰胺组（n=116）29.35±8.42 21.62±6.41* 60.38±18.52 62.42±19.42*联合治疗组（n=116）29.34±8.41 16.24±5.14* 60.37±18.50 68.59±22.36*t 值 0.009 7.052 0.004 2.244 P 值 0.993 0.001 0.997 0.026组别 ALP（U/L）AST（U/L）治疗前1 d 治疗后1 d 治疗前1 d 治疗后1 d吡嗪酰胺组（n=116）116.35±31.25 92.36±28.51* 29.42±9.24 22.15±6.32*联合治疗组（n=116）116.33±31.24 81.36±22.26* 29.40±9.22 14.85±3.21*t 值 0.005 3.275 0.017 11.090 P 值 0.996 0.001 0.987 0.001

2.5 两组肺功能水平比较

两组治疗前1 d 肺功能水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后1 d 肺功能水平均明显升高，且与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组肺功能水平均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组肺功能水平比较（±s）

表4 两组肺功能水平比较（±s）

*与本组治疗前1 d 相比，P＜0.05。

组别 每分钟MVV（L）FEV1（L）FEV1/FVC%（%）治疗前1 d 治疗后1 d 治疗前1 d 治疗后1 d 治疗前1 d 治疗后1 d吡嗪酰胺组（n=116）50.36±16.24 55.62±18.59* 1.41±0.26 1.58±0.29* 52.52±16.41 55.48±16.95*联合治疗组（n=116）50.34±16.22 63.24±20.36* 1.40±0.24 1.82±0.36* 52.50±16.40 60.68±19.26*t 值 0.009 2.977 0.304 5.592 0.009 2.183 P 值 0.993 0.003 0.761 0.001 0.993 0.030

2.6 两组临床疗效比较

与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组治疗总有效率较高，差异有统计学意义（χ2=8.624，P=0.003），见表5。

2.7 两组不良反应发生情况比较

与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组不良反应总发生率较高，但差异无统计学意义（χ2=0.338，P=0.561），见表6。

表6 两组不良反应发生情况比较

3 讨论

耐多药肺结核是一种较严重的结核耐药类型，临床治愈率较低，一旦患病，对于患者健康会造成不可挽回的伤害及损伤[7]。临床上主要采用药敏试验结果对耐多药肺结核进行诊断[8-9]。近年来，虽然肺结核的诊断技术不断提高，但结核病发病率仍处于高水平，控制形势依然严峻[10]。目前耐多药肺结核发病率不断上升，因此本文研究治疗耐多药肺结核有效的药物具有重要的意义。

贝达喹啉是一种二芳基喹啉类化合物，它通过抑制结核分枝杆菌ATP 合成酶，阻止分枝杆菌的ATP 能量供应，达到杀菌和灭菌的效果[11]。它能特异性地与分枝杆菌的三磷酸腺苷合成酶结合并消耗ATP。具有新的抗结核机制。在体外实验中，贝达喹啉能强烈抑制结核分枝杆菌分离株的耐药、药敏，对处于休眠状态中的分枝杆菌也具有杀菌作用[12]。吡嗪酰胺是唯一可以在巨噬细胞半休眠状态下杀灭结核分枝杆菌的抗结核药物，因此，在耐多药肺结核的治疗过程中使用效果较好[13]。吡嗪酰胺是现代结核病短期化疗的基本药物之一。然而，随着吡嗪酰胺的广泛应用，其耐药情况也越来越严重[14]。本研究结果显示，贝达喹啉及吡嗪酰胺治疗耐多药肺结核可有效提高治疗总有效率，效果显著。

microRNA（miRNA）是一类约22 nt 的非编码单链RNA，可通过抑制特异性mRNA 分子，介导基因转录后调控，参与细胞许多生物学过程，在许多疾病的发生及发展中均具备一定的调控作用。近年来，对miRNA 表达和功能的研究显示，miRNA水平在结核病患者机体中存在着异常于健康机体中的表达，提示其水平可能一定程度上与结核病的发生存在一定联系，临床可以将miRNA 作为肺结核病情的判断标志物，通过观测其水平变化来掌握肺结核疾病程度。miR-223 可通过抑制巨噬细胞内核因子κB 活性，削弱机体的抗结核免疫可通过减少促炎症因子的表达，从而抑制巨噬细胞凋亡[15]。郭存炳等[16]研究发现，耐多药肺结核患者使用莫西沙星可有效降低miR-155 水平从而提高化疗效果。目前，miR-155 被认为与叉头转录因子3 的表达在结核病发病机制中相关。本研究结果显示，与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组miR-223、miR-155 水平均明显降低，说明贝达喹啉及吡嗪酰胺治疗耐多药肺结核效果较优。

ADA 是一种水解酶，在嘌呤核酸代谢中起着重要的作用。在淋巴细胞中ADA 含量最高，而在组织、细胞中含量较高，与淋巴细胞的激活和分化显著相关[17]。CRP 是急性期反应蛋白，能促进免疫反应的调节和补体的活化，是诊断肺结核的常用炎症指标[18]。IL-6 是炎症细胞分化的主要调节因子，在发生内外伤、外科手术、应激反应、感染、脑死亡、肿瘤产生及其他情况的急性炎症反应过程中IL-6会快速升高，同时上调其他炎症细胞因子的表达，加重炎症损伤、神经根超敏，最终引起疼痛等相关症状[19]。IL-2 是一种趋化因子家族的细胞因子，来源于多细胞，具有多向作用，它在免疫应答和抗病毒感染中发挥重要作用[20]。ALP 是一种广泛分布在人体肝、肾、胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶[21]。ALT 存在各种细胞内，其中在肝细胞最为广泛，整个肝脏内转氨酶含量大约是血液中含量的100 倍[22]。AST 主要分布在心肌，其次是肝脏、骨骼等组织中。相关研究显示，耐多药肺结核患者肺功能异常表达，肺换气、肺通气处于较差的状态[23]。本研究结果显示，与吡嗪酰胺组相比，联合治疗组ADA、CRP、IL-6、IL-2、ALT、ALP、AST 水平均明显降低，FEV1、FEV1/FVC%、每分钟MVV 水平均明显上升，这一结果说明联合应用贝达喹啉、吡嗪酰胺治疗耐多药肺结核患者可有效改善肺功能，降低炎症反应，效果显著。

综上所述，联合应用贝达喹啉及吡嗪酰胺治疗耐多药肺结核患者可降低miR-155、miR-223表达量，有效改善肺功能，减轻肝累及损伤，效果显著。