先天性巨结肠早期诊断的研究进展

郑 懿 余家康

广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科 （广州 510623）

先天性巨结肠又被称作为赫尔施普龙病（Hirschsprung’s disease，HSCR），是以消化道末端肠神经节细胞缺如为基本病理特征的消化系统先天性畸形，占儿童消化系统出生缺陷疾病谱的第二位，发病率约1∶5 000，是小儿外科临床工作中的常见病与诊疗重点［1］。目前认为HSCR主要的病理生理改变是在胚胎发育期间，来源于迷走神经干的肠神经嵴干细胞（enteric neural crest cells，ENCCs）迁移到结肠中形成被称为肌间神经丛（Auerbach丛）（在肠壁的平滑肌肌层之间）和黏膜下神经丛（Meissner丛）（在肠壁的黏膜下层内）的肠神经网络，如果这一生理发育过程中ENCCs迁移障碍，则会导致结肠为主的肠神经丛发育缺陷，缺乏成熟的调节肠分泌和蠕动功能的神经节细胞，病变肠段持续痉挛失去收缩功能，导致长期粪便潴留，近端肠管在压力下代偿性肥厚扩张，造成患儿腹胀、便秘、肠炎、营养发育不良等肠梗阻的临床症状［2］。对于新生儿期发病的患儿，多在出生后即出现胎便排出延迟、腹胀进行性加重，严重者可发生巨结肠相关性小肠结肠炎，甚至肠穿孔的风险，这也是HSCR患儿新生儿期致死的主要原因。根据HSCR的病理学分类标准，我国学者将其分为：短段型、常见型（普通型）、长段型和全结肠型，以及更为罕见的全肠型和特殊类型［3］，其中以长段型及以上，即累及横结肠及以上肠段的病理类型，具有更高的术前肠炎反复发作、甚至穿孔的风险。文献报道，约5%新生儿期起病的患儿因结肠穿孔接受手术造瘘治疗，而术前出现巨结肠相关性小肠结肠炎的概率亦高达6%～60%［4-5］。因此早期进行疾病的诊断并及时预防干预，对于降低并发症的发生和围术期病死率尤为重要。

1 传统诊断方法在婴幼儿患者中应用

目前钡灌肠是低日龄患儿尤其是新生儿期的主要诊断方法，相较于其它方法，钡灌肠具有操作简单，创伤小、结果客观、易于普及等优点，典型影像特征表现为狭窄与扩张交界的移行段肠管显影、毛刺样的黏膜形态、结肠袋结构消失、24小时排泄相钡剂潴留，但由于新生儿尤其是小于35周龄的早产儿肠神经系统发育尚未完全，肠神经节密度及形态存在日龄差异性，敏感度和特异度分别仅为70%和83%，远低于6月龄以上的婴幼儿患者，而在长段型及以上的患儿中，典型的影像学特征与肠神经节缺如的病变范围差异率甚至高达42%，且对于低日龄患儿，灌肠操作及钡剂残留也存在肠梗阻、肠穿孔等风险［6-7］。而肛门直肠测压创伤相较更小，但技术本身具有一定人员及仪器设备要求，且有研究发现，在小于6个月婴儿的诊断准确性的亚组分析中，其敏感度和特异度仅为85%～89%，在新生儿患儿中直肠肛门抑制反射更是难以引出，经过与直肠活检这一金标准进行结果比对发现，两者差异也很大，因此并不是低日龄患儿的首选检查方法［8］。当然，随着技术水平的进步，亦有更精确、更灵敏的传感器或图像处理系统面世，也将提高肛门测压的应用年龄降低及准确率［9］。

活组织检查创伤较大，但此为疾病诊断的金标准，主要有直肠黏膜抽吸活检和全层活检两种方法，直肠黏膜抽吸活检操作相对简便，其特异度可高达95%，但敏感度波动也较大，与患儿日龄密切相关，一项回顾性研究表明，小于39天的患者中，诊断敏感度仅为50%，而较大年龄组中可达88%，这可能与新生儿期肠神经仍处于不断发育成熟过程有关［10-11］。抽吸活检往往无法充分暴露齿状线，取材过程中有可能涉及直肠末端生理性无神经节细胞区，抽吸过程可能得不到足够多的黏膜下层样本，是影响诊断特异度的因素。为进一步提高活检阳性检出率，可采取全层肠活检，能够提供较多的肠管层次及组织量，但麻醉、创伤、出血及吻合口瘘的风险也会相应升高，一般仅针对新生儿期急性肠梗阻需手术治疗的病人，直肠上段的全层肠活检可作为HSCR排除性诊断的有效方法［12］。另外，标本的组织化学染色也是对病理诊断的补充，较为常用的为乙酰胆碱酯酶染色和calretenin化学染色，但二者也存在假阴性的可能性，因此也有越来越多的组化染色辅助诊断指标被发现。胆碱转运体染色是较为常见的替代方案，有研究发现，异常的胆碱转运体染色贯穿整个无神经节肠段，并进入移行段，尤其在超短段型患儿的应用中可以减低calretinin的假阴性率［13-14］。另外，亦有其它神经元特异性标记物，包括NCAM、PGP9.5、HuC/D、S-100等也应用于辅助病理诊断，但神经节细胞是否存在及其形态、肥大神经丛的识别仍是病理诊断至关重要的特征［12，15-16］。基于上述，传统诊断方法在新生儿期HSCR疾病早期诊断中的应用仍存在限制及不足。因此越来越多的研究聚焦于疾病早期、无创、且特异度相对较高的诊断指标的挖掘及探索。

2 新型的可视化影像诊断技术

基于上述传统常规诊断方法在低龄婴幼儿尤其是新生儿期应用的限制，如钡灌肠及直肠肛门测压的诊断效率较年长儿低，病理活检穿孔及出血等并发症的发生率较年长儿高［2］，新型的影像可视化技术也辅助优化新生儿期HSCR的诊断。光谱成像技术优势在于无创的采样方法，经过特殊的计算机算法，可以提高正常与无神经节肠管的分辨率，动物研究中已证实，HSCR小鼠模型可达到97%敏感度及94%特异度，阳性诊断率为92%，此项技术有望在日后应用于术中辅助手术医生明确病变范围［17］。基于光学断层扫描（optical coherence tomography，OCT）技术开发的高分辨光学断层显微镜，脱离了实验室特殊化学染色的限制，实现可视化深层组织中肌间神经丛的分布，在小日龄HSCR小鼠模型中能够清晰区分正常与无神经节肠段［18］。激光共聚焦内窥镜（confocal laser endomicroscopy，CLE）是另一种可视化肠神经丛的技术，具有可应用于活体内观察的优点，通过神经元特异性结合染料，更直观显示结肠黏膜下神经丛，对于活体内神经丛的术中诊断准确率可达88%，但其技术限制在于共聚焦层面而对于结肠结构的分层识别较困难，在不平整的活体肠道中将聚焦平面聚集在诊断层面是主要的技术挑战［19］。另外，超声在诊断领域应用广泛，超高频超声在HSCR诊断的研究中发现，HSCR患儿离体病理肠管标本可以进行正常和无神经节段的超高频超声成像，对于解剖层次的识别比CLE更为清晰，可应用于不同年龄段患儿肠神经节数量及密度的评估，此项研究为肛门拖出先天性巨结肠根治术中诊断切除范围奠定了临床应用基础［20］。此类影像学检查手段具有较高的技术要求，且仍需要更多的人体样本验证，暂未得到广泛应用。

3 具有遗传背景的基因诊断

由于HSCR产前诊断中缺乏典型胎儿筛查特征，且该病为非孟德尔遗传，表型表达多样，外显率不完全，是多个遗传基因座和表观遗传/环境因素之间复杂相互作用的结果，因此单独的基因诊断，尤其是产前诊断困难，但遗传学分析可以帮助临床医生进行风险分级并识别高危患儿，例如长段型较短段型患者后代中疾病发生的概率明显增高，患儿兄弟姐妹中疾病风险根据病理类型及性别，最高可达33%［21］。非综合征HSCR占受影响儿童的70%，约30%受HSCR影响的儿童具有相关的染色体（12%）和/或伴有其它系统的出生缺陷（18%）［22］。与HSCR相关的常见综合症包括唐氏综合征、Waardenburg综合征、Goldberg综合征、多发性内分泌肿瘤2A、先天性中央通气不足综合征和Mowat-Wilson综合征等，若围生期检测发现上述综合症相关基因突变，则提示儿科医生应评估伴发肠神经系统异常的可能，减低患儿巨结肠危象的发生风险［23-25］。

截至目前，有关HSCR的发病机制尚不明确，目前研究表明常见的非编码变异、罕见的编码变异和影响肠神经嵴细胞命运的基因拷贝数变异均在HSCR 基因组研究中被发现，通过外显子测序、功能基因组测序和单核苷酸多态性基因拷贝数分析，发现可以在约50%具有明显表型的婴儿中鉴定出可能对巨结肠病易感的相关变异［26］。有文献报道，HSCR的遗传学背景是复杂的，涉及多个易感基因座，酪氨酸蛋白激酶受体（protooncogene tyrosine-protein kinase receptor，RET），位于染色体位点10q11，其相关通路是目前学界认为与HSCR的发生发展最相关的变异，其基因变异检出率最高（21.7%），其次是EDNRB、NRG1和NTRK1的突变（13%），L1CAM、CYP2B6和GEMIN2的突变（4.3%），它们加剧了与RET基因相关的遗传易感性，而家族性病例的基因变异检出率更是高达87.5%，明显高于散发性病例的40%［27］。综合症型HSCR的围产期遗传咨询，特别是对于已有明显家族聚集性倾向、并在先证者中已检测到已知有害突变的家系病例，应被视为遗传诊断管理的一部分［28］。但同时也有研究发现，RET突变相关HSCR患者的基因型和表型无直接关系，对具有家族遗传背景的产前羊水样本和脐带血进行检测，确认胎儿存在RET突变，但在随访中发现未表现出典型的HSCR疾病表型特征，这表明该病是一种具有多种表型表达和不完全外显的非孟德尔遗传病［28］。这也符合“基因-环境”相互作用学说的理论，在易感基因突变的遗传背景条件下，孕期的环境因素，如叶酸的摄入、视黄醇合成的缺乏等因素均可导致神经元及神经胶质细胞亚型转化异常及神经营养功能的缺失，最终表现为相似遗传背景下的不同外显率［29-30］。因此，单一的基因组层面检测在临床上对疾病诊断的帮助有应用条件，更多的获益存在于高危新生儿中的筛查和诊断提示，例如，研究发现父母中有一方为长段型巨结肠，其新生儿有 20% 的患病风险［22］，所以在临床工作中，对于一些遗传和家族风险较高的新生儿，即使没有典型的临床症状，根据具体情况也可能进行直肠病理活检，进一步避免延误诊断和治疗的风险，但在缺乏进一步研究完整性的情况下，使用产前检测进行干预可能还为时过早。

4 血浆游离生物标记物的早诊指标

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指一类不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，主要分为短链的siRNA、miRNA和piRNA，以及长链的lncRNA。研究发现，神经嵴细胞在胚胎发育过程中的增殖、迁移和分化是多个基因共同调控的结果，基因的表达和抑制受到多种因素的影响。但miRNA在进化过程中高度保守，在胚胎早期神经发育过程中具有明显的时序性，如与神经可塑性相关的miRNA132和miRNA124，与神经退行性病变相关的miRNA221和miRNA101［31-32］，研究亦证实lncRNA可以调节神经发育中的关键基因，并通过多种方式影响神经元和胶质细胞的转分化，包括抑制转录、染色质重塑和明显的修饰［33］。因此在ncRNA领域的研究中，miRNA和lncRNA均有研究证实与HSCR的发病密切相关，近些年也被应用于疾病的无创性早期诊断中。

外周血miRNA在循环中相对稳定，检测方法相对简单。它最早被用于肿瘤疾病的早期诊断。研究发现外周血miRNA可以反映早期肿瘤的存在，与肿瘤的晚期侵袭、转移、复发、化疗敏感有关。例如，miR-1246、miR-21和miR-155通过miRNA芯片检测与食管癌的侵袭和复发相关，可作为一种新的疾病诊断和预后标志物［34］；外周血外泌体中检测的miRNA包括let-7a，miR-1229，miR-1246，miR-150，miR-21，miR-223、miR-23a和miR-378的表达与结直肠癌的诊断和预后密切相关［35］。因此，在HSCR早期诊断领域的研究，也聚焦于循环miRNA在该疾病早期诊断及预后的应用。有研究发现，在患者和正常对照的血清标本中，miR-133a、miR-218-1、 miR-92a、miR-25 和 miR-483-5P 与疾病的发生正相关，可以作为HSCR新的无创性早期筛查血清标志物［36］。鉴于miRNA的丰富性以及miRNA与靶基因之间的非单一配对关系，在HSCR复杂的遗传背景下，一些学者筛选了不同miRNAs组合的表达谱芯片，用于疾病的早期诊断或巨结肠相关肠炎的检测，而血浆外泌体中存在更稳定的内源性miRNAs，通过外泌体的提取和表达谱的鉴定，发现miR-494-3p、miR-668-3p、miR-323a-3p和miR605-3p的高表达与miR-5701的低表达和疾病的发生有关，可用于早期无创诊断［37］。LncRNA在HSCR诊断方面的研究相对较少，这主要是因为早期认为LncRNA为转录副产物，生物学效应不明，随着研究的不断深入，学者发现LncRNA通过结合转录因子、增强子、组蛋白等特定区域也可以发挥转录或转录后修饰的作用，具有调控功能基因表达的作用，例如lncRNA-MDl通过结合miR-133和miR-135影响MAMLl和MEF2CE基因的表达，参与肌细胞的分化功能［38］。在肠神经早期分化与发育过程中，lncRNA也发挥重要作用，如lncRNA表达谱芯片检测HSCR扩张与狭窄肠管发现，ENST00000467240.1、ENST00000479039.1、ENST00000485020.1、TCONS00007196和NR034126.1有明显差异表达；lncRNA-HAll7可能通过DPF3调控神经增殖与分化成熟［39-40］。虽然目前尚没有LncRNAs用于HSCR早期诊断的临床效能评估研究，但这仍是疾病辅助诊断的备选之一。

5 不足与展望

HSCR仍然是儿童外科、胃肠病和遗传学面临的临床挑战，尽管过去十几年来，疾病的诊断和围术期管理取得了很多诊疗进展，但在改善该疾病儿童的长期预后方面仍任重道远。疾病早期特异性高的诊断方法可以避免消化系统发育不良、严重便秘甚至危及生命的小肠结肠炎的发生，对于降低漏诊率、改善预后至关重要。随着病理学、遗传学和新型影像技术的进步与发展，未来必定可以提高绝大多数病例快速、无创和准确的诊断效率。其次，为更好地体现神经节细胞密度和不同亚型神经元比例的病理特征，对于患者“正常神经节”的定义也需进一步规范。描绘不同年龄层次和不同取材部位的大数据疾病组织图谱将是推进我们研究的关键。最后，手术仍然是基于切除无神经节细胞段为目的，术式的选择在过去十几年间并没有明显变化，希望随着早期诊断和无创检测技术的不断进步，能够对疾病进行更早的评估和干预，降低围术期并发症，改善患儿预后，并对干细胞治疗等多样化的综合治疗方法进行研究和临床转化，这将是未来疾病诊疗研究的重要方向。