血清miR-499联合PLTP水平对不停跳冠状动脉旁路移植术后心房颤动的预测价值

王春丽, 王凤丹, 周 敏, 方垂璧, 孙 骁

(上海交通大学医学院附属第九人民医院心脏外科, 上海 201900)

冠心病是冠状动脉粥样硬化引起冠状动脉狭窄、供血不足所致的心脏器质性功能改变,是导致我国居民死亡的重要原因之一[1]。非体外循环下不停跳冠状动脉旁路移植术(off-pump isolated coronary artery bypass grafting,OPCABG)是外科治疗合并多支血管病变的复杂冠状动脉疾病的主要术式之一,虽然成功率较高,但术后常并发心房颤动(atrial fibrillation,AF),严重影响患者术后转归[2]。及时、准确的预测OPCABG后AF对改善患者预后至关重要。研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)能通过调控多种机制参与AF进程[3]。miR-499是一种保守的miRNA,有学者通过TaqMan探针法分析AF电重构相关miRNA发现,miR-499在AF乳鼠心房肌细胞中表达上调[3]。研究表明,血脂水平与AF发生发展有关[4]。磷脂转移蛋白(phospholipid transfer protein,PLTP)是一种糖蛋白,能通过介导脂蛋白间磷脂交换调控脂蛋白代谢[5]。有学者通过蛋白质组学、代谢组学和生物信息学分析发现,PLTP是冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)后AF发生的差异表达代谢物[6]。然而关于血清miR-499、PLTP水平与OPCABG后AF的关系及预测价值尚不清楚,基于此本研究报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年1月至2022年6月我院收治的237例接受OPCABG术的冠心病患者,女97例,男140例,年龄(59.89±9.26)岁,范围37～83岁;体质指数(23.51±2.50)kg/m2,范围18.05～30.64kg/m2;根据术后是否发生AF分为AF组69例和非AF组168例。纳入标准:①冠心病符合《临床冠心病诊断与治疗指南》[7]诊断标准:冠脉造影显示冠状动脉主干或主要分支管腔狭窄≥50%;②冠状动脉造影发现多支血管病变,或冠状动脉支架狭窄无再通或无法行冠状动脉支架置入术;③行OPCABG术治疗;④AF符合《2016年欧洲心脏病学会心房颤动管理指南》[8]诊断标准:术后至住院期间心电监护或心电图提示P波消失,代之以振幅、频率不等的f波,持续时间≥10min;⑤年龄≥18岁;排除标准:①既往AF、病态窦房结综合征、房室传导阻滞史;②同期行瓣膜置换、瓣膜修补等手术;③先天性心脏疾病;④严重肝肾功能不全、严重感染、电解质紊乱、甲状腺功能异常等不能耐受手术;⑤血液、神经、免疫系统损害和恶性肿瘤;⑥院内死亡、资料不完整;⑦近3个月内使用β受体阻滞剂以外的抗心律失常药物。本研究患者及家属均知情研究,经医院伦理委员会批准。

1.2方 法

1.2.1资料收集:收集本组患者性别、年龄、体质指数、吸烟、饮酒、病史、术前超声心动图[彩色多普勒超声诊断仪(美国GE,型号:Voluson E8)检查左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室收缩末期直径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)、左心室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左心房内径(left atrial diameter,LAD)]、术前用药[β受体阻滞剂、他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)类药物、钙通道阻滞剂]、术中旁路重建情况(左前降支、回旋支、右冠状动脉、总支数)、手术情况[手术时间、机械通气时间、重症监护室(intensive care unit,ICU)停留时间、主动脉球囊反搏辅助、二次开胸止血]等资料。

1.2.2血清miR-499、PLTP水平检测:采集患者OPCABG术前空腹静脉血4mL,3000r/min离心15min(半径8cm),分置两管冻存于-80℃冰箱中。一管血清使用Trizol试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司,编号:ALH011)提取总RNA,Takara反转录试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司,编号:AG11705)合成cDNA。按照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(上海赫果生物科技有限公司,编号:DRR820A)说明,采用PCR仪(美国ABI,型号:ABI7500)进行PCR扩增,反应条件:95℃ 90s、95℃ 30s、63℃ 30s、72℃ 15s,循环40次后收集Ct值,以U6为内参校正,2-ΔΔCT法计算血清miR-499相对表达量。miR-499引物:上游:5′-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3′,下游:5′-AAACAUCACUGCAAGUCUUAA-3′;U6引物:上游:5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3′,下游:5′-UGUCCGAGUUGCUUCCCGA-3′。另一管血清采用酶联免疫吸附法(上海一研生物科技有限公司,货号:EY-elisa2736)检测PLTP水平。

2 结 果

2.1两组患者血清miR-499、PLTP水平比较:AF组血清miR-499水平高于非AF组,PLTP水平低于非AF组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者血清miR-499 PLTP水平比较

2.2两组患者一般资料比较:AF组年龄大于非AF组,糖尿病比例、LAD高于非AF组,机械通气时间、ICU停留时间长于非AF组,差异有统计学意义(P<0.05);两组性别、体质指数、吸烟、饮酒、高血压、高脂血症、心肌梗死等资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组患者一般资料比较

2.3OPCABG后AF患者血清miR-499与PLTP水平的相关性:经TargetScan数据库7.2预测,miR-499与PLTP存在结合位点(图1)。Spearman相关性分析显示,OPCABG后AF患者血清miR-499与PLTP水平呈负相关(rs=-0.789,P<0.001)。见图2。

图1 miR-499与PLTP的结合位点图

图2 OPCABG后AF患者血清miR-499与PLTP水平的线性散点图

2.4OPCABG后AF的多因素Logistic回归分析:以年龄、糖尿病(赋值:有=1;无=0)、LAD、机械通气时间、ICU停留时间、miR-499、PLTP为自变量(连续变量均原值录入),OPCABG后是否发生AF(赋值:是=1;否=0)为因变量。多因素Logistic回归分析显示,年龄、糖尿病、LAD、miR-499为OPCABG后AF的独立危险因素,PLTP为独立保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 OPCABG后AF的多因素Logistic回归分析

2.5血清miR-499、PLTP水平对OPCABG后AF的预测价值:ROC曲线分析显示,血清miR-499联合PLTP水平预测OPCABG后AF的AUC大于miR-499、PLTP单独预测(Z=3.154、3.804,P=0.002、0.000)。见表4和图3。

图3 血清miR-499、PLTP水平预测OPCABG后AF的ROC曲线

表4 血清miR-499 PLTP水平对OPCABG后AF的预测价值

3 讨 论

近年随着生命科学的快速发展,越来越多研究证实miRNA参与AF发生发展[3]。miR-499定位于人染色体20q11.22,主要表达于心肌,Zhou等[9]研究报道,新生大鼠心肌梗死后心肌细胞大量释放miR-499,能通过损伤血管内皮加剧梗死后血管炎症,这项研究提示miR-499升高会加剧心肌损伤。Ling等[10]通过miRNA阵列分析心脏手术后AF患者的心房组织,发现miR-499在AF患者心房组织中升高了33.01倍,进一步通过细胞实验发现miR-499能通过小电导钙激活钾离子通道3调节心房电重构。李艳茹等[3]研究也发现,miR-499是AF乳鼠心房电重构高表达miRNA之一。本研究结果显示,血清miR-499水平升高为OPCABG后AF的独立危险因素,说明miR-499水平升高可增加OPCABG后AF风险,分析原因可能与miR-499水平升高能促进心房电重构有关。心房电重构可导致心房折返和激动无序,导致AF发生和维持[11]。最近Ling等[12]研究亦证实,miR-499升高能导致L型钙离子电流和电流振幅减慢并失去活力,从而引起心房电重构。

胆固醇是质膜的重要组成部分,对维持细胞膜流动性和完整性至关重要,胆固醇降低可导致细胞膜完整性破坏,进而影响离子通道在细胞膜上流动来产生和调节电位,引起心脏电活动异常而导致AF。PLTP是一种脂质代谢相关蛋白,能通过介导血浆脂蛋白间磷脂转移和交换,从组织中转运多余的胆固醇,介导高密度脂蛋白的转化和修饰,并能促进肝脏极低密度脂蛋白生成[5]。既往研究证实,PLTP敲低或抑制PLTP能显著抑制动脉粥样硬化进程[13]。本研究结果显示,血清PLTP水平升高为OPCABG后AF的独立保护因素,说明PLTP水平升高可降低OPCABG后AF风险,这与Li等[6]报道结果相符。可能是因为PLTP能促进胆固醇生成,维持细胞膜流动性和完整性,保护离子通道在细胞膜上流动来产生和调节电位,避免心脏电活动异常,从而降低AF风险[14]。

本研究通过网站预测发现,miR-499与PLTP存在结合位点,相关性分析也证实二者在OPCABG后AF患者血清中表达呈负相关,提示miR-499与PLTP可能共同参与OPCABG后AF发生,分析可能是PLTP降低会使细胞膜流动性和完整性受损,能促进miR-499介导的离子通道蛋白功能异常,进而引起心脏电活动异常和心房电重构,促进AF发生[10,15]。最后通过绘制ROC曲线结果显示,血清miR-499联合PLTP水平预测OPCABG后AF的AUC,较miR-499、PLTP单独预测的AUC显著增加,提示血清miR-499、PLTP水平可能成为OPCABG后AF的辅助预测指标,且血清miR-499联合PLTP水平能提升其预测价值。

综上所述,OPCABG后AF患者术前血清miR-499水平明显升高,而PLTP水平明显降低,二者可能共同参与OPCABG后AF发生,且可能成为OPCABG后AF的辅助预测指标,但本研究结果还需大样本研究证实。