CEACAM1在肺腺癌中表达及免疫浸润分析

陈海欣 陈平 陈婷婷

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其主要病理类型包括非小细胞肺癌（NSCLC）及小细胞肺癌（SCLC），其中NSCLC 约占85%［1］。肺腺癌（LUAD）是原发性肺癌中最常见的组织学亚型，50%的LUAD患者被发现时已经处于晚期并存在远处转移，转移性肺癌5 年生存率为4%~18%［2-3］。癌胚抗原（CEA）作为恶性肿瘤诊断的重要指标，在结肠癌、胃癌、肺癌等肿瘤中表达均存在增高［4］。CEA 作为一种细胞膜结构蛋白，参与细胞黏附，异常升高可以促进肿瘤细胞转移［5］。癌胚抗原相关细胞黏附分子1（CEACAM1）是CEA 家族中唯一在T 细胞和NK 细胞等免疫细胞上表达的成员，抑制免疫细胞抗肿瘤功能［6］。本研究拟通过TCGA-LUAD 和HPA 数据库，分析CEACAM1 在LUAD 肿瘤组织中表达情况，CEACAM1 与肿瘤浸润免疫细胞的相关性，探索CEACAM1 与多种免疫检查点共表达关系，分析CEACAM1 在LUAD 免疫细胞中调节作用以及CEACAM1 在LUAD 参与的信号通路，为CEACAM1 是否可以作为治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料收集 从TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载LUAD 项目中HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 数据和患者临床资料用于CEACAM1 差异表达、免疫浸润、免疫检查点共表达及通路富集分析。

1.2 方法 （1）差异表达分析：对TCGA-LUAD 数据库中肿瘤组织和癌旁组织CEACAM1 表达进行差异分析，R 软件包“ggplot2”用于可视化分析。通过HPA 数据库（https：//www.proteinatlas.org）分析LUAD 肿瘤组织中免疫组化结果，分析肿瘤组织和癌旁组织中CEACAM1 表达差异。（2）KM 生存曲线分析：应用KM 数据库（http：//kmplot.com/analysis/）分析不同病理分期CEACAM1 高低表达组总生存率（overall survival rate，OS）差异。（3）免疫浸润分析：应用R 软件包“GSVA”进行免疫浸润分析，免疫浸润算法为ssGSEA。分析CEACAM1 与肿瘤浸润的免疫细胞的相关性，免疫细胞选择活化的树突状细胞（aDC）、B 细胞、CD8T 细胞、细胞毒性细胞、DC细胞、嗜酸性粒细胞、幼稚的树突状细胞（iDC）、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞，CD56+NK 细胞，CD56-NK 细胞、NK 细胞、浆细胞样树突状细胞（pDC）、T细胞、T 辅助细胞、中央记忆型T 细胞（Tcm）、效应记忆T 细胞（Tem）、滤泡辅助性T 细胞（TFH）、γδ T细胞、Th1 细胞、Th17 细胞、Th2 细胞和调节性T 细胞（Treg）。（4）CEACAM1 与其他免疫检查点共表达情况分析：应用R 软件包“ggplot2”用于可视化分析，分析CEACAM1 与其余8 个免疫检查点（SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3 和PDCD1LG2）共表达情况。（5）通路富集分析：根据CEACAM1 表达情况分为低表达组和高表达组，分析两组中存在表达差异显著的基因，并通过GSEA 基因富集分析。使用P值和归一化富集分数（normalized enrichment fraction，NES）对每个表型中富集的途径进行分类。若错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.25 且校准P<0.05 表明在高表达表型中显著富集。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0 统计软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，两组比较用t检验；偏态分布计量资料以M（Q1，Q3）表示，两组比较用秩和检验；计数资料以n（%）表示，用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床资料比较 TCGA-LUAD 数据库中，排除缺少RNAseq 数据或临床信息的患者，相同患者保留原位癌数据，最后共筛选出535 例LUAD 患者纳入本次分析，以肺肿瘤组织中CEACAM1 表达量的中位值作为界限，将患者分成高表达组（268 例）和低表达组（267例）。见表1。

表1 LUAD患者临床资料

2.2 CEACAM1 在肿瘤组织和癌旁组织表达差异 通过非配对样本检验，LUAD 患者肿瘤组织中CEACAM1的含量高于癌旁组织的平均水平，两组差值为1.502（1.38~1.625），差异有统计学意义（t=24.151，P<0.001）；通过配对样本检验，肿瘤组织中CEACAM1 的含量也高于癌旁组织的平均水平，两组差值为1.423（1.134~1.712），差异有统计学意义（t=9.857，P<0.001）。见图1。

图1 CEACAM1在肿瘤组织和癌旁组织表达

2.3 CEACAM1 免疫组化结果分析 CEACAM1 在肿瘤组织中高表达，在正常肺组织中几乎不表达，见图2。

图2 CEACAM1在肿瘤组织和癌旁组织免疫组化结果（HPA数据库）

2.4 KM 生存曲线分析 在LUAD 中，CEACAM1 高表达患者OS 偏低（P<0.05）。由于IV 期患者数不足，因此只单独列出I、II、III 期和总LUAD 患者KM 生存曲线，结果显示I 和II 期高表达CEACAM1 的LUAD 患者OS 偏低（P<0.05）。而在III 期LUAD 患者中OS 差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 LUAD中CEACAM1高低表达组KM生存曲线分析

2.5 免疫浸润相关性分析 CEACAM1 与aDC、B 细胞、嗜酸性粒细胞、iDC、T 细胞、TFH、Th1 细胞和Treg 细胞存在正相关（P<0.05），相关系数分别为0.192、0.109、0.124、0.087、0.146、0.288、0.089 和0.156，见图4。

图4 CEACAM1与肿瘤浸润免疫细胞相关性分析

2.6 CEACAM1 与免疫检查点共表达分析 CEACAM1与SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4和LAG3 共表达情况存在正相关（P<0.05），Spearman相关系数分别为0.141、0.166、0.092、0.108、0.149、0.163 和0.147，见图5。

图5 CEACAM1与免疫检查点分子共表达情况

2.7 通路富集分析 通过GSEA 通路富集分析，发现CEACAM1 与Rho GTP 酶信号传导、M 期有丝分裂、NABA 分泌因子、DNA 修复以及氨基酸及其衍生物的代谢通路相关。见图6。

图6 GSEA通路富集分析

3 讨论

LUAD 作为肺癌的主要病理类型，虽然恶性程度不高，发展进程比较缓慢，但存在微转移灶，即使肺部病灶较小时也会发生血道转移以及淋巴转移，大多数患者被诊断时，病情已经发展至中晚期，并且可能已经扩散到全身各处［7］。随着CEACAM 家族研究的深入，CEACAM1 在各种癌症中的研究也日益增多，比如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌以及黑色素瘤等［8-9］。在NSCLC 中，与健康者比较，CEACAM1 基因表达上调［10］。CEACAM1 可以通过改变细胞间的黏附能力，细胞间空隙增大使得肿瘤细胞侵袭进入组织器官，导致肿瘤侵袭和转移；通过促进VEGF的表达，使机体生成新生血管及淋巴管从而促进肿瘤转移［11］。有研究表明，在NSCLC 患者血清中，存在CEACAM1 水平升高，且表达水平和TGF-β、VEGF-A、IL-8 密切相关，提示CEACAM1 可以预测肺癌发生、进展以及预后，并有可能为肺癌治疗提供靶点［12］。另外，CEACAM1 免疫抑制剂（MG1124）在NSCLC PDX人源化小鼠模型中，MG1124 作为单一疗法可以抑制肺癌的生长，在NSCLC huPDX 模型中显示出与派姆单抗的协同抗癌活性。CEACAM1 作为近年新发现的免疫检查点，可以与TIM-3 相互作用抑制T 细胞抗肿瘤作用，使肿瘤细胞逃避免疫监视［13］。

本研究结果显示，与癌旁组织比较，LUAD 患者肿瘤组织中CEACAM1 mRNA 高表达。在一项CEACAM1和NSCLC 研究中，肿瘤组织中CEACAM1 高表达，表明CEACAM1 与NSCLC 存在关联［14］。通过KM 生存曲线分析，发现CEACAM1 高表达的早期LUAD 患者中OS偏低，推测CEACAM1 有可能是早期LUAD 不良预后指标。CEACAM1 作为免疫检查点，能够在免疫细胞上表达，从而调节免疫细胞激活程度，而免疫细胞的状态和患者的预后也密切相关，分析LUAD 患者CEACAM1与肿瘤浸润的免疫细胞相关性，结果显示CEACAM1 与多种免疫细胞呈正相关（P<0.05），其中与TFH 细胞相关性最显著。有研究表明，NSCLC 患者TFH 细胞上不仅存在PD1 高表达，也存在TFH 功能异常，功能异常可以进一步抑制免疫功能，抢救TFH 的功能可以作为NSCLC 患者潜在的治疗策略［15］。研究证实LUAD 中CEACAM1 与TFH 浸润呈正相关，高表达的CEACAM1也同样会抑制TFH 细胞功能，通过靶向抑制CEACAM1也有可能帮助恢复TFH 功能，从而也能对LUAD 患者起到治疗作用。CEACAM1 作为免疫检查点，可以与其他免疫检查点互相作用，如与TIM-3 结合对免疫细胞进行调控［15］。分析CEACAM1 与其他八种免疫检查点分子共表达情况，结果显示CEACAM1 与SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4 和LAG3 共表达情况存在正相关（P<0.05），提示可以联合多个免疫检查点抑制剂作为LUAD 治疗的新策略。根据肿瘤组织中CEACAM1 表达水平分为高低表达组，两组中存在显著差异的基因，通过GSEA 通路富集分析，发现CEACAM1 与Rho GTP 酶信号传导、M 期有丝分裂、NABA 分泌因子、DNA 修复以及氨基酸及其衍生物的代谢通路相关。Rho GTP 酶属于Ras 超家族，参与细胞迁移、吞噬、收缩和黏附，Rho/ROCK 信号通路可以诱导细胞骨架重建、导致内皮细胞通透性改变，与肿瘤的发生密切相关［16］。细胞分裂周期M 期通路，也有研究表明CDC 25C 可以预测LUAD 的不良预后，并可能在细胞周期调节和FAS 介导的细胞凋亡中发挥作用，其中CDC25C 参与G2/M 期转变的调节［17］。DNA 修复也与肿瘤密切相关，当修复系统存在延长，可能导致肿瘤发生。尚斌通过实验发现过表达Ku80 基因可以增加LUAD 细胞增殖、运动、迁移以及侵袭能力，其中Ku80基因是DNA 修复基因［18］。在多种肿瘤，如乳腺癌患者血清中存在氨基酸代谢图谱的改变［19］。根据基因富集分析，发现CEACAM1 参与的信号通路与肿瘤的发生密切相关，因此靶向CEACAM1 有可能阻止肿瘤的发生。综上所述，LUAD 的肿瘤组织中CEACAM1 高表达，且与肿瘤组织浸润的多种免疫细胞呈正相关。CEACAM1作为免疫检查点，在免疫细胞上高表达，可以抑制免疫细胞抗肿瘤功能，导致肿瘤细胞逃避免疫监视。另外，在LUAD 中，CEACAM1 可以和多种免疫检查点共表达，可能对免疫抑制起到协同作用。