基于泛素化机制的肺纤维化关键基因筛选与鉴定

王志翊 周培森 李科莹 杨静雯 翁杰 徐慧

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性间质性肺病［1］，预后极差，生存期为3~5 年，由于发病机制尚未明确，目前仍无特效治疗药物［2］。肺纤维化病理基础是成纤维细胞过度增殖、肌成纤维细胞活化及细胞外基质异常沉积等［3-4］。泛素化属于蛋白翻译后修饰过程，具有选择性调节蛋白降解功能，广泛参与细胞周期调控、凋亡、信号通路转导等过程，可直接或间接参与肺纤维化进程［5-6］。尽管肺纤维化部分关键泛素化基因已被发现，但这些孤立的基因尚不能解释肺纤维化复杂的发病机制。近年来，微阵列分析作为在基因组水平上获得基因表达数据的一种工具，已广泛应用于疾病的发生和发展研究中［7］。本研究拟通过GEO 数据微阵列分析，筛查肺纤维化相关的泛素化关键基因，并通过蛋白印迹实验（WB）验证，从泛素化角度探索肺纤维化可能发病机制，为临床寻找理想的生物分子诊疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取基因表达综合（geneExpression omnibus，GEO）数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）GSE47460 和GSE70866 两个数据集［8-9］。GSE47460 基于GPL14550 平台，包含91 例健康者与122 例肺纤维化患者的全肺基因表达数据。GSE70866 基于GPL14550和GPL17077 平台，包含20 例健康者与122 例肺纤维化患者的肺泡灌洗液基因表达数据。

1.2 差异表达基因（DEGs）分析 数据库人群分为肺纤维化组与正常对照组，采用R 语言进行原始数据分析，通过线性模型进行微阵列分析（limma 包）筛选出DEGs，以|log2 fold change（FC）|>0.5，且P<0.01 为DEGs 阈值。

1.3 PPI网络的构建 采用STRING数据库和Cytoscape软件［10］，构建差异基因蛋白的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，用Cytoscape 的cytoHubba 进行评分。

1.4 DEGs 的功能富集分析 采用R 包“clusterProfiler”对DEGs 进行基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，采用R 语言（enrichment plot 包和ggplot2 包）对结果进行可视化处理。

1.5 基于关键（Hub）基因表达高低进行预后特征的验证 通过PPI 网络筛选Hub基因，并按基因表达量中位数分为高表达组与低表达组，采用survival 包和survminer 包进行预后生存分析，比较高表达组和低表达组之间的生存差异，采用Kaplan-Meier 分析绘制生存曲线，用对数秩检验评估统计显著性。

1.6 肺纤维化模型构建及泛素化Hub基因鉴定 SD 雄性大鼠18 只，体质量150~200 g，采用数字随机表分为正常对照组、肺纤维化组与UCHL1抑制剂组，各6 只。用乌拉坦麻醉各组大鼠，肺纤维化组按博莱霉素（BLM）5 mg/kg 气管内灌注，UCHL1抑制剂组采用LDN-57444（LDN）（0.25 mg/kg）腹腔注射，2 周后取各组大鼠肺组织。所有SD 大鼠购自Vital River（中国上海）实验动物技术中心，本研究经温州医科大学动物实验伦理委员会批准。

1.7 HE 染色和羟脯氨酸含量测定 分离大鼠肺组织，经4%多聚甲醛固定，常规脱水、包埋、切片后进行HE 染色。提取肺组织后，于试管中制成匀浆液，加入1 mL 水解液，充分混匀后加盖沸水水浴20 min，调节水解液pH 值为6.5，加入适量活性炭混匀离心，取1 mL上清液作检测，计算羟脯氨酸含量。

1.8 统计学方法 用R 软件进行统计分析及图像生成，计量资料用表示，两组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泛素化相关的差异表达基因的筛选 数据集GSE47460均为胸外手术患者，提取肺组织匀浆总RNA，并进行微阵列分析，肺纤维化组与正常对照组临床信息比较见表1。筛选泛素化相关基因约600 多个，包括泛素活化酶（E1 酶）、泛素结合酶（E2 酶）、泛素连接酶（E3 酶）、去泛素化酶（DUB）、蛋白水解酶（PRO 酶）等。通过Limma 包进行肺纤维化组与正常对照组间泛素化相关差异表达基因分析，以|logFC|>0.5 且P<0.01的阈值共鉴定出38 个泛素化相关差异基因（17 个上调基因和21 个下调基因），泛素化相关的差异基因热图和火山图，见图1。

图1 泛素化相关的差异基因热图与火山图

表1 两组人群临床资料比较

2.2 泛素化相关差异基因GO 和KEGG 富集分析 上调的差异表达泛素化相关基因分析结果显示，GO 和KEGG 的主要存在于泛素化相关通路的调控，包括泛素蛋白酶体、泛素转移酶及泛素连接酶等，见图2。下调的差异表达泛素化相关基因分析结果显示，主要存在于蛋白质分解调控、蛋白质分解代谢调控及泛素转移酶等，见图3。

图3 下调泛素化差异基因的GO和KEGG分析

2.3 蛋白间相互作用网络（PPI 网络）与Hub基因筛选 采用Cytoscape 软件构建基于STRING 数据库的PPI 网络。DEGs 的PPI 网络见图4A。通过CytoHubba的11 种评分对38 个差异基因做进一步筛选，选出9 个Hub基因，见图4B。

图4 蛋白间相互作用网络和CytoHubba评分

2.4 差异表达基因与肺纤维化患者生存率关系 数据集GSE70866 包含122 例预后生存信息的肺纤维化患者微阵列数据，为分析泛素化Hub基因表达水平改变对肺纤维化患者生存率影响，分别选择5 个Hub基因UBE2C、RHOBTB2、CUL3、USP30及UCHL1。 采 用Kaplan-Meier 分析各Hub基因与患者总体生存率间关系，发现UCHL1高表达组患者生存时间明显低于低表达组，其他4 个基因高和低表达组间无明显差异，见表2、图5。

图5 Hub基因Kaplan-Meier曲线

表2 Hub基因Kaplan-Meier曲线高表达和低表达间的比较

2.5 肺纤维化大鼠模型鉴定与Hub泛素化相关差异基因验证 HE 染色结果显示，肺纤维化组肺泡间隙较正常对照组明显增厚。UCHL1抑制剂组与正常对照组肺组织结构清晰。UCHL1抑制剂组大鼠肺泡壁略有增宽，较肺纤维化组肺泡壁明显改善。肺纤维化组羟脯氨酸含量高于正常对照组，而UCHL1抑制剂组羟脯氨酸含量低于肺纤维化组，见图6。蛋白免疫印迹实验结果显示，相较于正常对照组，肺纤维化组中UCHL1蛋白表达上调，见图7。

图6 三组HE染色和羟脯氨酸含量比较

图7 肺纤维化大鼠肺组织UCHL1表达情况

3 讨论

本研究应用生物信息学分析从数据集GSE47460中鉴定肺纤维化组和正常对照组差异表达基因，并进一步分析其中的泛素化相关基因，筛选出17 个上调和21个下调的泛素化相关差异基因，为了更好理解这些差异基因的相互作用，分别进行了GO 和KEGG 分析。研究表明，38 个泛素化相关差异基因的GO 和KEGG 分析结果主要存在于泛素化相关的信号通路，包括泛素蛋白酶体、泛素转移酶及泛素连接酶等。通过构建PPI 网络并应用Cytoscape 软件筛选出与肺纤维化发病机制及预后相关的重要Hub基因，分别分析了包括泛素结合酶E2C（UBE2C）、RHOBTB2、CUL3、USP30、UCHL1在内的Hub基因，为肺纤维化机制研究提供了新的思路。

泛素是一种存在于所有真核生物中的小蛋白，可在翻译后调节底物蛋白的稳定性，从而广泛调节细胞功能。越来越多的证据表明泛素化有助于肺纤维化的病理组织重塑［11］。泛素E3 连接酶FIEL1 在肺成纤维细胞中通过Smad3/4 信号通路，表现出促纤维化［6］。去泛素化酶USP13 的缺失导致成纤维细胞具有更强的增殖、迁移和侵袭能力［12］。泛素E3 连接酶UHRF1 通过GPX4和FSP1 介导肺泡上皮2 型细胞的铁死亡，促进肺纤维化［13］。本研究虽通过生物信息学分析，从GEO 数据库中筛选出UBE2C、RHOBTB2、CUL3、USP30、UCHL1等肺纤维化差异表达基因，但有关其在肺纤维化发病进程中的作用及机制，目前尚不清楚。

UBE2C 是特异性E2 泛素耦联酶，在较多肿瘤组织中过表达，与ECM 调控相关［14］。CUL3 是一种泛素E3 连接酶，在肿瘤中也高表达，可促进肿瘤细胞增殖［15］。也有研究表明，CUL3 表达失调可导致纤维化肾病。RHOBTB2 是一种小的Rho GTP 酶，可与泛素E3连接酶cullin-3 蛋白相互作用，可抑制乳腺癌的生长和扩散。去泛素化酶USP30 可抑制线粒体自噬，通过抑制USP30 可阻断帕金森蛋白驱动线粒体自噬从而缓解帕金森的进展［16］。UCHL1则是一种参与调节帕金森病、心肌损伤、肺癌、乳腺癌和结肠癌等多种疾病的去泛素酶［17］。上述泛素化相关基因在肺纤维化患者中表达升高，提示其在肺纤维化发病过程中可能具有重要作用。同时，本研究通过Kaplan-Meier 曲线分析也发现上述泛素化相关基因具有良好的预测肺纤维化患者生存能力，其中UCHL1预测能力最强。通过动物实验，进一步证实大鼠纤维化肺组织中UCHL1蛋白表达也明显升高，抑制UCHL1则可明显缓解BLM 诱导的肺纤维化严重程度。由此可见，UCHL1在肺纤维化发病机制中可能扮演重要角色，但具体机制仍有待进一步研究。

综上所述，本研究提出几个与肺纤维化相关的泛素化Hub基因，尤其是UCHL1与肺纤维化的发病机制及预后关系密切。后续有待进一步通过细胞和动物实验深入研究，为从泛素化角度寻找新的肺纤维化临床治疗靶点奠定理论基础。