浙贝母花不同化学成分提取物体内抗氧化作用

郭燕娜 胡华杰 周国儿 张雷芳

浙贝母植株是以鳞茎入药，其花和地上部分常被作为废物丢弃［1］，造成资源浪费。因此，深入开发浙贝母花等遗弃物生物资源，是浙贝母产业一个发展方向。陈文君等［2］研究后初步断定浙贝母中的地上茎和花同样具有一定的药用价值。马文华等［3］研究发现浙贝母多糖具有较好的体外抗氧化活性。近年来，研究发现浙贝母花除含有与其鳞茎中相似的生物活性物质如生物碱和皂苷外，还含有黄酮类、脂肪酸、氨基酸等成分［4-5］。但浙贝母花的相关基础研究较为缺乏，也鲜有研究其不同提取物体内抗氧化能力。因此，本研究探讨浙贝母花不同化学成分在小鼠体内的抗氧化活性，以期为进一步开发与临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 酶标仪AMR-100（南京菲奇工贸有限公司），超声波清洗仪WF-150EH（宁波海曙五方超声设备有限公司），旋转蒸发仪N-1100、冷却水循环装置CA-1111（上海爱朗仪器有限公司），离心机CF16RN（HITACHI 公司），超低温冰箱FORMA991（赛默飞世尔上海仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A（上海精宏实验设备有限公司），冷冻干燥机ALPHA 1-4/LDPlus（CHRIST 公司）。

1.2 主要药品与试剂 浙贝母花采自浙江省舟山市金塘镇，经舟山市中医院周国儿主任中药师鉴定为百合科贝母属植物浙贝母Fritillariae thunbergii Miq.的花。维生素C（批号ST1434）、D-半乳糖（批号ST1218）均购自碧云天生物技术有限公司。乙醇（批号20211115）、石油醚（批号20201110）、乙酸乙酯（批号20210629）、正丁醇（20200831）均购自国药集团化学试剂有限公司，总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（批号S0101S）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（批号BC0200）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号S0131S）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（批号S0056）均购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验动物 健康ICR 品系小鼠。雄性，体质量25~30 g，购自杭州子源实验动物有限公司，采用SPF级饲喂。

1.4 浙贝母花不同成分提取 将烘干后的浙贝母花打碎成粉末。称取4 kg 的浙贝母花粉加5 倍量的80%乙醇超声重复浸提3 h，抽滤得到浙贝母花乙醇提取液。经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分别得到浙贝母花的石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，浓缩、冷冻干燥，存放于-80℃冰箱中保存。

1.5 动物分组、造模及给药 小鼠适应性饲养1 周，将42 只雄鼠随机分成空白组、模型组、阳性对照组、浙贝母花乙醇提取物组、浙贝母花石油醚萃取物组、浙贝母花乙酸乙酯萃取物组、浙贝母花正丁醇萃取物组，每组6 只。对照组每天皮下注射等体积0.9%氯化钠溶液，其余各组每天皮下注射D-半乳糖（300 mg/kg）。给药组和模型组经皮下注射D-半乳糖30 min 后，对照组和模型组小鼠采用蒸馏水灌胃，给药组分别给予浙贝母花乙醇提取物（500 mg/kg）、浙贝母花石油醚萃取物（500 mg/kg）、浙贝母花乙酸乙酯萃取物（125 mg/kg）、浙贝母花正丁醇萃取物（62.5 mg/kg），阳性对照组给予维生素C 溶液（100 mg/kg），使用前以少量0.5% CMC-Na 配制成悬液，冷藏备用。空白组给予等体积的0.5%CMC-Na 水溶液。连续皮下注射和灌胃相应药物四周。

1.6 动物处理和采集样本 实验小鼠在给药结束后，24 h 内禁食，解剖前记录小鼠体质量。采用眼球取血法采集小鼠血液，3,000 r/min 离心10 min，取其上清液即为血清样品，放置于-80℃超低温冰箱中储存。取血完毕后处死小鼠，并立即对其肝脏、脑组织、脾脏和胸腺组织进行解剖。肝脏、脾脏和胸腺组织于解剖后0.9%氯化钠溶液清洗残留血液和脂肪组织，吸干表面多余水分后进行称重，记录数据用于测定其脏器指数。肝脏和脑组织分别置于EP 管内，-80℃超低温冰箱中保存。

1.7 抗氧化指标的测定 按照相应的试剂盒说明书测定小鼠血清、脑组织、肝组织匀浆中SOD、MDA、CAT、GSH-Px 的含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件。多组间比较用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浙贝母花不同化学成分提取物对衰老小鼠器官指数的影响 与空白组相比，模型组小鼠肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数均降低（P<0.05 或P<0.01）。与模型组比较，不同给药组小鼠肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数均有所提高，其中石油醚给药组器官指数提高明显（P<0.05）。表明D-半乳糖对小鼠的脏器指数有明显的抑制作用，而浙贝母花提取物尤其是石油醚提取物能较好的缓解D-半乳糖所致脏器指数的下降。见图1。

图1 小鼠肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数变化

2.2 血清、肝脏和脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平的测定 D-半乳糖诱导的衰老小鼠SOD 含量明显下降（P<0.01），而浙贝母花浸提物不同成分对D-半乳糖致SOD 的影响则不同程度的改善，其中石油醚萃取物，在血清、肝脏及脑组织中均能提高SOD（P<0.01），见图2。

图2 小鼠血清、肝脏、脑组织中SOD水平变化

2.3 肝脏和脑组织CAT 水平测定 与空白组相比，模型组脑组织中CAT 水平降低（P<0.01），肝脏中CAT 水平极降低（P<0.001）。与模型组相比，给药组小鼠CAT水平均有所提高，石油醚萃取物组肝脏和脑组织中CAT水平均提高（P<0.01）。表明模型组小鼠CAT 水平降低，浙贝母花不同部位提取物均能不同程度减轻D-半乳糖引起的肝脏及脑组织CAT 水平降低，其中石油醚萃取物给药组维持CAT 水平最佳，见图3。

图3 小鼠肝脏、脑组织中CAT水平变化

2.4 血清、肝脏和脑组织中MDA 水平测定 与空白组相比，模型组血清、肝脏和脑组织中MDA 水平提高（P<0.01 或P<0.001）。与模型组相比，各给药组MDA水平均降低，而在肝脏及脑组织中石油醚和正丁醇萃取物能降低MDA 水平（P<0.01），见图4。

图4 小鼠血清、肝脏、脑组织中MDA水平变化

2.5 肝脏和脑组织GSH-Px 水平测定 与空白组相比，模型组肝脏中GSH-Px 水平降低（P<0.01）、脑组织中GSH-Px 水平降低（P<0.001）。与模型组相比，给药各组小鼠GSH-Px 水平均有所提高，乙酸乙酯萃取物组和石油醚萃取物组在肝脏及脑组织中GSH-Px 水平提高（P<0.05），见图5。

图5 小鼠肝脏、脑组织中GSH-Px水平变化

3 讨论

我国拥有丰富的中药资源，其功效与安全性也得到较为清晰的认识。中药中的天然抗氧化剂由于其具有价格便宜、毒副作用小等优点，因此越来越受到专家和学者的重视［6］。近年来，通过对中药化学成分的研究发现，多糖、黄酮类化合物等有显著的抗氧化活性［7-8］。彭伟等［5］从贝母花乙酸乙酯和正丁醇提取物分离、鉴定并通过化学成分研究，基本明确浙贝母花中的主要成分为黄酮、甾体类和脂肪族化合物。本实验结果表明，石油醚及乙酸乙酯提取物的抗氧化效果较佳，推测其可能存在较好的抗氧化活性物质，此类物质为脂溶性较好的物质。彭伟等［5］已经明确从乙酸乙酯提取物中分离得到13 个化合物，包括正十七醇、十七烷酸单甘油酯、异鼠李素等在内的5 种新成分。而这些成分中，可能存在很好的抗氧化活性。本次实验中，存在MDA数据不稳定现象，刘玉贞等认为在测定MDA 时标本最好不溶血，实验结果中出现MDA 结果与前期抗氧化能力的出入，原因可能与血清中存在溶血有关，可以进一步改善试验方法

本研究中，通过检测小鼠血清、肝脏和脑组织中SOD、MDA 水平，肝脏和脑组织中CAT、GSH-Px 水平，结合脏器指数的观察发现，浙贝母花不同化学成分提取物均可升高因D-半乳糖导致的低SOD、CAT、GSH-Px 水平，降低因D-半乳糖导致的血清和组织中MDA 水平，具有一定的抗氧化作用。其中石油醚提取物及乙酸乙酯提取物的抗氧化效果最佳，推测其有效的抗氧化活性物质可能为脂溶性物质。