CD40通路对内皮祖细胞NO生物活性及功能的调控作用

潘加欢 潘艳云 祁晨阳 朱敏 毛威

内皮祖细胞（EPC）是一种具有分化及增殖能力的成熟血管内皮细胞（EC）的前体细胞［1］。其可以在体内分化为成熟ECs，通过迁移、黏附、增殖，相互连接之后组成血管腔样的结构，直接形成新血管；也可以结合入血管内膜，释放保护性旁分泌因子参与内皮细胞损伤后的修复过程，加速血管内皮再生、改善血管内皮功能［1-2］。因此EPCs 成为防治多种血管疾病的重要靶细胞。然而，内源性EPCs 在高血压、糖尿病、高血脂等疾病环境中数量减少且功能减退，不能很好在病变组织中执行修复任务［2-6］。GIANNOTTI 等［6］研究进一步表明EPCs 数量和功能受损是导致血管内皮功能障碍重要原因之一。EPCs 移植已被应用在多种血管损伤动物疾病模型中包括肺动脉高压（PAH）、动脉粥样硬化（AS）等，其被证实可作为一种全新的内皮损伤的治疗方式；国内外学者也已完成多项通过输注自体EPCs 治疗心血管病患者的临床研究并获得较好的疗效［7-10］。但目前研究证明即使移植的EPC 功能在炎症环境中也会受损［8-10］，因此，研究EPCs 损伤的机制将是未来EPC 治疗的关键方向。

慢性炎症浸润是大多数心血管疾病的典型病理改变［9，11］。促炎介质可溶性CD40 配体（sCD40L）血浆浓度升高是包括PAH、AS 等炎症相关血管疾病的特征改变之一［11］。CD40L及其受体CD40 属于肿瘤坏死因子超家族［12］。除了跨膜形式，CD40L 也有较短的可溶性形式sCD40L，并具有更强的生物学活性。CD40/CD40L 轴在参与调节多种细胞的免疫、炎症反应中具有多种作用，包括单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞（SMCs）、巨噬细胞、ECs 和EPCs 等［11-13］。已有大量证据证明CD40 通路的激活可以减少EPCs 数量并损害EPCs 活性［13-14］，但其潜在机制仍不明确。

一氧化氮（NO）作为重要体液因子，不仅能够维持血管正常舒张功能，还能抑制血小板聚集并修复血管损伤，调节体内糖、脂代谢平衡；同时也调控多种管壁细胞包括ECs、SMCs 的生长周期和增殖等，是防治心血管疾病重要的分子物质。存在于人体内NO 的含量不多，主要由ECs 生成合成，其一氧化氮合酶（NOS）可分为nNOS、iNOS 积eNOS 三种亚型，三者在维持心血管内平衡起重要调节作用。血管NO 合成很大程度上与eNOS 有关，且eNOS 活性或蛋白水平将决定NO 合成水平的高低，多种心血管疾病发病机制中包含eNOS/NO 失调的因素。NO 生物利用度的降低可能是CD40 通路激活后介导EPCs 数量减少和能力损伤的关键因素；而NO 生物利用度的升高可能部分逆转炎症条件下EPCs 的功能障碍。

1 CD40通路的激活损害EPC的功能

ECs 损伤被认为是血管损伤发生发展过程中的前哨事件，并随后诱导血管重构［1，4］。EPCs 向ECs 的分化已被认为是其治疗益处的主要机制。EPCs 的正常黏附、增殖、分化和并入血管结构是内皮修复的关键。EPCs 的这些功能在患者中受损［5-6］。离体实验也证实：sCD40L 预处理后，体外培养的正常EPCs 的黏附、迁移、增殖功能受损，旁分泌的炎性因子增多，且该效应呈剂量相关［13］。研究报道sCD40L 处理后，EPCs 在VLA-5 配体纤维连接蛋白、Mac-1 配体纤维蛋白原、Mac-1 与淋巴细胞功能相关抗原-1 联合配体细胞间黏附分子-1、VLA-4 配体VCAM-1 上的增殖和黏附减少，细胞活力也明显呈剂量依赖性下降。管壁局部EPCs 的数量依赖于细胞本身的增殖和与血管中表达的黏附分子，这对于内皮修复至关重要［15］。此外，细胞动员前的骨髓局部EPCs 的增殖能力及数量也被认为在后期的迁移归巢运动中起关键作用［16］。EPCs 功能障碍与新生内膜重塑增加和再内皮化减弱相关。在体动物研究发现：与经sCD40L 预处理的EPCs 相比，通过输注对照EPCs 可改善内膜层的完整性、连续性，减少炎症浸润及血管重构，同时经EPCs 免疫荧光定位证实，经sCD40L预处理的EPCs 移植后在血管内膜层的定位减少，而CD40 基因敲除的EPCs 更好定植在内膜层，且增殖数量明显多于对照组，这不仅和EPCs 的趋化相关，更与其细胞本身良好的增殖、黏附、分泌等功能有密切关联。以上充分表明CD40 通路的激活能改变本体甚至移植EPCs 的功能［13］。

2 CD40通路的激活损害EPC的运动

动员、趋化、归巢、迁移是EPCs 的主要运动形式。大部分EPCs 存在于造血干细胞和骨髓基质细胞提供的造血微环境中并保持静止状态。作为对损伤和细胞因子等外周刺激的反应，EPCs 动员释放到外周血中，随后进入新血管或受损组织的所在地，称为归巢［17-18］。归巢是EPCs 黏附并分化并入内膜层的先决条件。EPCs 数量越大，血管健康状况和修复潜力越好［1-4］。除了增殖能力外，EPCs 对外周刺激的敏感性对EPCs 数量至关重要。然而，血管疾病患者的循环EPCs 数量和正常活动减少［5-6］。EPCs 从骨髓中释放出后能否有效迁移、归巢至受损部位，是血管再生和损伤修复的关键。EPCs 的归巢机制尚不十分清楚，目前多数观点认为归巢的启动源于缺血损伤微环境中各种信号的释放。主要包括基质细胞衍生因子（SDF-1），血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）以及黏附因子（VCAM-1）等。在这些信号因子作用下，激活EPCs 上的相应受体通路SDF-1α/CXCR4，ICAM-1/CD18（integrinβ2）和 VCAM-1/integrinα4 等，介导EPCs 向血管损伤部位集中，并修复血管。SDF-1α/CXCR4 信号轴又被认为是EPCs 归巢的关键环节之一。CD40 通路的激活被证明会减弱EPCs 的运动能力［13-14，17］。sCD40L 预处理后，SDF-1 和VEGF 诱导的EPCs 迁移呈剂量依赖性减弱［14］。晚期抗原-4（VLA-4）和VCAM 也在EPCs 的归巢中发挥重要作用，经sCD40L 预处理后，其与EPCs 的相互作用也减弱［15］。相反，动物模型移植EPCs 的实验中，用带慢病毒荧光载体标记移植细胞，免疫共聚焦定位后发现，野生型EPCs在炎症环境下可进入组织间隙及管壁各层，而CD40 基因沉默的EPCs 并不会减弱归巢能力，反而能更好定植在血管内膜层而不是外膜或中膜层［13］。

3 CD40通路对EPC的作用机制

局部eNOS/NO 的生物活性是维持EPCs 正常归巢和修复能力的核心条件［19-20］。然而，大多数血管疾病通常以NO 生物活性降低为特征。血管损伤动物模型移植EPCs 治疗后血清eNOS 上升，而 PI3K/Akt/eNOS 途径也是EPCs 介导血管内膜修复的关键途径［19］。NO 生物活性受损会减弱骨髓对外周刺激的反应，导致循环EPCs 水平下降。在骨髓中，破坏细胞与基质微环境之间的黏附相互作用是EPCs 动员的关键［17-18，21］。趋化因子如VEGF、SDF-1、白细胞介素（IL）-8、粒细胞集落刺激因子和Grob 诱导的EPC 动员主要依赖于基质金属蛋白酶（MMP）-9 的局部分泌［22-24］。NO 在调节MMP-9 的基础表达和活性中起关键作用。降低NO 水平不能有效刺激MMP9表达，导致EPCs 进入循环受阻［22-24］。研究证实野生型EPCs在应用于循环时有效，但不能从eNOS 缺乏小鼠的骨髓中释放（NOS3-/-）；此外，静脉输注或骨髓移植NOS3-/-细胞也不能挽救野生型动物受损的新生血管［22］。糖尿病周围血管病患者EPCs 中eNOS、NO 的表达明显减少，EPC 的迁移、黏附、增殖功能下降。高水平的NO 合成酶抑制剂可导致EPCs的分化、增殖、黏附和并入血管结构的能力呈浓度依赖性降低［23］。相反，提高NO 生物活性的物质，如生长激素和胰岛素生长因子（IGF），对循环EPC 水平有刺激作用。促红细胞生长素可通过动员EPC，促进损伤内膜再内皮化过程，抑制新生内膜的过度增殖［24］。同样，他汀类药物可以通过PI3K/Akt 通路激活eNOS，增加EPCs 的数量并促进其分化［20］。

研究发现sCD40L 与NO 的生物活性密切相关。一方面，sCD40L 可以直接降低eNOS mRNA 和蛋白质水平、eNOS mRNA 稳定性和/或eNOS 转录活性、eNOS 酶活性，最终降低细胞NO 水平，这些下调作用可被抗CD40L 或抗CD40 抗体有效阻断［12，25］。因此，激活CD40 通路诱导的eNOS 和NO降低可能导致EPCs 功能障碍。另一方面，氧化应激是炎症反应的特征也是CD40 轴调控NO 的机制［26］。氧化应激损害EPCs 的黏附、迁移和再内皮化能力，同时促进EPCs 的凋亡和衰老［27］。除了直接损害细胞内的细胞器和分子外，更重要的是，高浓度的活性氧降低了对氧化应激高度敏感的NO 可用性，并拮抗内皮细胞NO 生成的保护作用［27］。O2-可以消耗NO 形成过氧亚硝酸盐（ONOO-），并触发p38、ERK1/2 和NF-κb 的激活，从而降低eNOS 水平和NO 的生物活性［25，27］。sCD40L 降低线粒体膜电位、过氧化氢酶、ATP 水平和SOD 活性，同时激活NAD（P）H 氧化酶，从而刺激细胞内活性氧（ROS），从而改变NO 的生物活性［25-26］。然而，经过NAD（P）H 氧化酶抑制和超氧化物歧化酶（SOD）处理后，NO 的生物活性得以恢复，再内皮化反应也得以恢复［27］。

4 小结

EPC 移植作为一种新兴的治疗方法，离广泛的临床应用还有较长的路。寻找合理的优化方法是EPC 治疗的未来研究方向。血管内膜损伤常伴有慢性炎症浸润。但直接抗炎治疗在AS/PAH 等血管疾病的临床应用中尚存争议，因此进一步深入了解其潜在病理发生机制有助于确立新的研究靶点及临床治疗方案。本文对经典促炎信号通路CD40 通路进行深入分析，并提出NO 生物活性可能是CD40 通路介导EPC 功能改变的关键因素。可以考虑在EPC 输注时采用NO 相关基因修饰的EPC 治疗或临时靶向信号通路辅助治疗。