高温和干旱胁迫下茶树叶片内源激素含量变化及其相关基因的表达分析

唐子贻，杜玥，杨宏斌，黎星辉，余有本*，王伟东*

高温和干旱胁迫下茶树叶片内源激素含量变化及其相关基因的表达分析

唐子贻1，杜玥1，杨宏斌1，黎星辉2，余有本1*，王伟东1*

1. 西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100；2. 南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095

高温干旱极端环境严重影响茶树生长发育，以及茶叶产量和品质，激素作为植物响应逆境胁迫的重要信号因子，其在茶树响应高温和干旱胁迫过程中的分子机理少有报道。以龙井长叶为材料，对高温和干旱胁迫下茶树叶片中内源激素含量的变化及其相关基因的表达水平进行了系统分析。结果表明，高温和干旱胁迫下茶树叶片中生长素（IAA）、赤霉素（GA3）含量显著降低，玉米素核苷（ZR）含量略有升高，推测茶树通过减少促生类激素来延缓生长以适应胁迫影响；同时，大量IAA、GA3、ZR生物合成和信号响应相关的基因显著差异表达，为解释激素含量变化及信号转导提供了分子基础。脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）作为逆境响应激素其含量在高温和干旱胁迫下均显著增加，这可能依赖于、、等ABA生物合成途径基因和、、等JA生物合成途径基因的上调表达；另外，许多、等ABA信号途径基因以及、等JA信号途径基因也显著差异表达，暗示了ABA和JA信号途径在茶树响应高温和干旱胁迫过程中的重要作用。研究结果为进一步探究茶树依赖内源激素的高温和干旱胁迫响应分子机理提供理论参考。

茶树；内源激素；脱落酸；茉莉酸；基因表达分析；非生物胁迫

茶树[(L.) O. Kuntze]是我国重要的经济作物，其栽培过程中经常遭受各种不良环境的影响。近年来全球气候变暖，随之而来的高温干旱极端天气对茶树生长发育造成了极大损害，严重影响了茶叶的产量和品质[1]。因此，了解茶树高温和干旱胁迫响应机理，对提高茶树高温、干旱抗性，培育高抗优良茶树品种至关重要。

植物激素是植物体内一类重要的小分子有机化合物，如脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、生长素（IAA）、玉米素核苷（ZR）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）、独脚金内酯（SL）等，不仅参与调控植物正常生长发育，而且在植物抵抗外界胁迫干扰中也发挥重要作用[2-3]。面对不良环境，植物往往通过调节内源激素含量与比例响应外界变化，调控基因表达，改变生理状态，从而提高植物逆境生存能力[4-5]。而现有研究亦表明，植物激素对于茶树逆境响应同样至关重要[6-7]。例如，ABA通过调控茶树叶片气孔开闭以减少干旱胁迫下水分的流失[8]；SA通过基因激活茶树-非依赖型抗性通路，从而增强茶树对干旱胁迫的耐受性[9]；茶树通过调节ABA等生长抑制类激素与IAA、GA等生长促进类激素平衡来应对低温胁迫[10]；JA能够通过调控家族基因表达提高茶树对多种逆境胁迫的适应能力[11]。此外，外源激素施用也被证实对缓解极端温度以及重金属胁迫对茶树的伤害有显著效果[12]。然而，关于高温和干旱胁迫下茶树内源激素的分子响应机理研究较为有限。

因此，本研究通过分析高温和干旱胁迫下茶树叶片中内源激素的含量变化，结合转录组数据探究内源激素，特别是ABA与JA合成代谢及信号响应相关基因的表达变化趋势，以期为明确内源激素参与茶树高温和干旱胁迫响应的分子机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料与处理

供试材料为两年生龙井长叶品种茶树水培苗，于西北农林科技大学人工气候温室进行预培养，培养条件为12 h光照/12 h黑暗，光照温度25 ℃，黑暗温度22 ℃，空气相对湿度(75±5)%，营养液每周更换1次。选取生长健壮、长势一致的茶苗分别进行高温（40 ℃）和干旱（20% PEG 6000）胁迫处理，在高温胁迫处理0 h（CK）、2 h（HT2）、6 h（HT6）、12 h（HT12）和24 h（HT24），以及干旱胁迫处理0 h（CK）、2 h（PEG2）、12 h（PEG12）、24 h（PEG24）和48 h（PEG48）取新梢第2～3叶位的嫩叶并于液氮中速冻，–80 ℃冰箱保存备用。每个时间点设3个生物学重复。

1.2 激素含量测定

内源激素的提取和纯化参考曾光辉等[13]方法，将茶树叶片样品置于预冷的研钵，加提取液充分研磨后离心取上清液，上清液经C18固相萃取柱纯化后稀释定容备用。通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定IAA、GA3、ZR、ABA、JA激素的含量，所用试剂盒由中国农业大学提供。每个样品重复测定3次。

1.3 差异表达基因分析

转录组原始数据（SRA ID：PRJNA428407）用Fastp进行质控后获得高质量clean reads，使用Hisat2将其比对到舒茶早品种茶树基因组[14]，用FeatureCounts软件对基因counts数进行统计和标准化，并以TPM（Transcripts per kilobase million）表示基因的表达水平[15]。采用edgeR软件包对基因表达进行差异分析，以|Log2FC|≥1且FDR＜0.05为标准筛选显著差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证

1.5 数据统计分析

使用IBM SPSS v20.0软件对试验数据进行统计分析，用单因素ANOVA进行方差分析，用Duncan’s新复极差法进行多重比较，用皮尔逊相关系数法对激素含量和相关基因表达水平进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对茶树叶片内源激素含量的影响

如图1A和1B所示，高温胁迫下茶树叶片中IAA和GA3含量显著降低，在高温处理6 h时较CK分别降低了28.25%和39.44%，之后其含量均维持在一定水平。ZR含量在高温胁迫处理2 h时迅速上升，较CK升高了41.85%，之后有所降低并随处理时间的延长而缓慢上升，整体呈现出上升趋势（图1C）。JA含量随着胁迫时间延长不断升高，至处理24 h时含量高达30.80 ng·g-1，较CK增加了155.81%（图1D）；类似的，ABA含量在高温胁迫处理后显著增加，在处理12 h时含量达225.20 ng·g-1，较CK增加了55.74%，随后稍有下降，整体呈上升趋势（图1E）。另外，（GA3＋ZR＋IAA）与ABA比值在高温胁迫下迅速降低，但在处理24 h时有所回升，暗示了茶树叶片基于激素水平平衡的潜在高温胁迫适应能力。

注：不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。下同

2.2 干旱胁迫对茶树叶片内源激素含量的影响

干旱胁迫下茶树叶片中IAA含量显著降低，处理12 h后维持在一定水平，整体较CK降低了25%左右（图2A）；类似的，GA3含量在干旱胁迫处理初期亦显著降低，在处理12 h时较对照组降低了34.18%，之后开始回升（图2B）；相反，ZR含量在干旱胁迫处理后逐渐升高并在24 h后开始下降（图2C）。JA含量随着干旱胁迫时间延长不断升高，在处理24 h后增速明显加快，处理48 h时含量较CK增加了86.98%（图2D）；ABA含量在干旱胁迫下也显著增加，在处理24 h时含量达224.89 ng·g-1，较CK增加了55.53%，之后略有降低（图2E）。（GA3＋ZR＋IAA）与ABA比值在高温胁迫下迅速降低，处理24 h后趋于稳定，维持在较低水平（图2F）。

2.3 IAA、GA3、ZR合成代谢及信号响应相关差异表达基因分析

高温或干旱胁迫下发现大量激素信号相关的DEGs，其中IAA相关的DEGs数量明显高于GA3和ZR相关DEGs数量（表2）。IAA生物合成相关的黄素单加氧酶基因（Flavin-containing monooxygenase gene）在高温和干旱胁迫处理后均显著下调表达，其可能是胁迫下IAA含量降低的关键调控因子；多个IAA信号响应基因，如、、和，在胁迫下呈现出先下调后上调的表达趋势。GA3相关DEGs以下调基因为主，但是调控活性GAs生成的关键酶基因与上调表达，而诱导GAs失活的下调表达，这与胁迫中GA3含量下降恰恰相反，结合GA1、GA4等其他具有生物活性GAs同样受上述关键酶调控，推测和表达水平变化可能有利于其他活性GAs的生成，而竞争性限制了GA3合成。另外，关键赤霉素受体基因在高温胁迫下为下调表达，而在干旱胁迫下为上调表达，表明其在不同胁迫下具有不同的响应机制。ZR相关DEGs以上调为主，包括生物合成关键酶基因、，活性调控酶基因，以及信号转导途径关键基因和等。

表2 茶树叶片植物激素信号转导通路中的差异表达基因

注：↑表示上调表达，↓表示下调表达

Note: ↑ indicates up-regulated expression, and ↓ indicates down-regulated expression

2.4 ABA生物合成及信号响应相关差异表达基因分析

如图3A所示，ABA生物合成途径大量调控酶基因在高温胁迫下上调表达，尤其是玉米黄素环氧化酶基因（Zeaxanthin epoxidase gene，）和短链脱氢酶/还原酶基因（Short-chain dehydrogenase/reductase gene，），且表达水平的增加主要集中在处理后的2、6、12 h，而在处理后24 h时基因表达水平均有所回落，这与高温胁迫下茶树叶片中ABA含量的变化趋势几乎一致；然而，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因（9--epoxycarotenoid dioxygenase gene，）和脱落醛氧化酶基因（Abscisic aldehyde oxidase gene，）在高温胁迫处理下均为下调表达。干旱胁迫下，、和均为上调表达，且表达水平的增加主要集中在处理12 h以后。同时，相关性分析结果显示，高温胁迫下的多个、基因表达水平以及干旱胁迫下的多个、基因表达水平与ABA含量呈正相关，表明其可能分别在高温和干旱胁迫诱导的ABA积累中发挥关键作用（图3A）。另外，ABA受体蛋白基因（Pyrabactin resistance/PYR1-like gene，/）和蛋白磷酸酶2C基因（Protein phosphatase 2C gene，）作为ABA信号途径中的核心因子，高温和干旱胁迫下大量编码基因显著差异表达，其中以上调表达为主，而整体呈现出先下调表达后上调表达的变化趋势，这与ABA含量变化趋势相反（图3B和3C）。

注：A为ABA合成途径DEGs表达谱，B和C为ABA信号响应途径DEGs表达谱。ZEP为玉米黄素环氧化酶基因，NCED为9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因，SDR为短链脱氢酶/还原酶基因，AAO为脱落醛氧化酶基因，AO为醛氧化酶基因，PYR/PYL为ABA受体蛋白基因，PP2C为蛋白磷酸酶2C基因。＋表示基因表达水平与激素含量呈正相关，－表示基因表达水平与激素含量呈负相关

2.5 JA生物合成及信号响应相关差异表达基因分析

高温胁迫下，JA生物合成途径中的-亚麻酸脂氧合酶基因（Lipoxygenase gene，）、12-氧代植物二烯酸还原酶基因（12-oxophytodienoate reductase gene，）、OPC8-CoA连接酶基因（OPC8-CoA ligase gene，）、酯酰辅酶A氧化酶基因（Acyl-CoA oxidase gene，）主要为上调表达，而丙二烯氧化合成酶基因（Allene oxide synthase gene，）和丙二烯氧化环化酶基因（Allene oxide cyclase gene，）则主要为下调表达；与之不同，干旱胁迫下几乎所有的关键酶基因均为上调表达，尤其是在干旱胁迫处理24 h时，这可能是高温胁迫处理48 h时JA含量增加迅速的重要原因（图4A）。同时，高温胁迫下的多个、、基因表达水平以及干旱胁迫下的多个、、、基因表达水平与JA含量呈正相关，表明其可能分别在高温和干旱胁迫诱导的JA积累中发挥关键作用（图4A）。另一方面，JA信号响应相关基因在高温和干旱胁迫下展现出完全不同的表达趋势，其中茉莉酰氨基酸结合物合成酶基因（JA conjugate synthase gene，）、茉莉酸ZIM结构域蛋白基因（Jasmonate ZIM-domain protein gene，）以及bHLH转录因子髓细胞组织增生蛋白基因（Myelocytomatosis proteins gene，）基因均为下调表达，而干旱胁迫下和差异表达基因均显著上调表达，表明JA可能通过不同的信号响应途径参与了茶树对高温和干旱胁迫的响应（图4B和4C）。

2.6 差异表达基因qRT-PCR验证

对ABA和JA生物合成或信号响应过程中的8个差异表达基因进行qRT-PCR验证，结果显示高温或干旱胁迫下基因表达水平与转录组分析结果呈现出类似的变化趋势（图5），表明RNA-Seq数据具有较高的可靠性。

3 讨论

植物激素作为植物胁迫响应的关键内源因子，通过不同激素信号途径的复杂网络及其相互间的信号交叉实现了对胁迫响应的精细调控[16]。IAA、GA3和ZR是植物体中促进生长发育的核心激素，其中IAA对植物细胞极性发育、细胞伸长至关重要，GA3能够调控气孔开闭、减少植物蒸腾以及促进植物生长，ZR可促进细胞分裂、扩大和延缓叶片衰老[17-18]。大量研究证实，逆境条件下植物通过减少促生类激素以延缓生长，从而抵御不良环境影响。我们的研究也发现高温和干旱胁迫下，茶树叶片中IAA和GA3的含量均显著降低，这与澳洲茶树、栀子、苜蓿和黑麦草在高温或干旱胁迫下IAA和GA3含量变化一致[19-22]。不同的是，高温和干旱胁迫下茶树叶片中ZR含量变化虽均有上升但趋势略有不同。前人研究证实，不同植物或同种植物不同逆境胁迫下ZR含量往往表现出不同的变化趋势，这种差异性变化表明了ZR在植物响应不良环境过程中功能的多元性[23]。另外，基于转录组数据的差异基因分析发现，、、、等IAA、GA3、ZR生物合成关键基因显著差异表达，其可能主导了高温和干旱胁迫下茶树叶片相关激素含量变化；同时，相关激素信号途径下游大量响应基因亦显著差异表达，如、、、等，这些结果解释了高温和干旱胁迫影响茶树叶片IAA、GA3和ZR含量的分子基础，也暗示了相关激素参与茶树高温和干旱胁迫响应的潜在信号途径。

注：A为高温处理，B为干旱处理

Note: A, heat stress. B, drought stress

图5 qRT-PCR验证转录组数据

Fig.5 qRT-PCR validation of RNA-Seq data

ABA作为一种逆境激素，在植物响应各种逆境胁迫过程中发挥着重要作用，如干旱胁迫下ABA迅速积累并通过诱导叶片气孔关闭减少水分流失以抵御胁迫损伤[24]，ABA通过维持水稻碳平衡和能量平衡以阻止高温胁迫导致的花粉败育[25]。本研究中，高温和干旱胁迫均诱导了茶树叶片ABA的快速积累，表明内源ABA参与了茶树对高温和干旱胁迫的适应过程，这与前人的研究一致[26]。目前，对于ABA生物合成途径已有较为清晰的认识，其中被认为是该途径的关键限速酶，是逆境胁迫下调控ABA含量变化的重要因子[27]。干旱胁迫下，我们发现多个编码基因显著上调表达，且其表达水平与ABA含量变化呈正相关，推测其在干旱胁迫诱导茶树叶片ABA积累中发挥重要作用。然而，高温胁迫下编码基因却下调表达，暗示其不同于干旱胁迫下的作用机制，这仍需继续研究。相比之下，和编码基因则在高温和干旱胁迫下均以上调表达为主，且多个基因表达水平与ABA含量变化呈正相关，表明其可能以类似的作用机制参与了高温和干旱胁迫诱导茶树叶片ABA合成积累过程。另一方面，与是ABA信号转导途径的核心因子，其编码基因在高温和干旱下显著差异表达，其中的表达趋势与ABA含量变化趋势一致，而则与之相反。结合植物ABA信号途径推测，响应高温和干旱胁迫通过诱导ABA变化抑制负调控因子，进而调控下游高温和干旱响应基因的表达，从而激活了茶树对高温和干旱胁迫的适应性过程[28]。

JA也被证实广泛参与了植物对逆境胁迫的响应，结合前人研究和含量测定结果表明JA同样被诱导参与茶树响应高温和干旱胁迫过程[29]，而且该过程伴随着、、、和等JA生物合成途径相关基因表达水平的增加，尽管响应时间上在高温和干旱胁迫下有所差异，但与相应胁迫下JA含量的变化趋势高度拟合，尤其是、、基因，这充分证明了上述基因表达水平的变化是高温和干旱胁迫诱导茶树叶片中JA积累的重要原因[30]。模块是研究最多的JA信号转导途径过程，本研究也发现多个、基因显著差异表达，但其在高温和干旱胁迫下完全展现出相反的表达模式，说明茶树在响应高温和干旱胁迫过程中所依赖的JA信号途径可能有所差异[31]。事实上，基于模块的JA信号途径不仅取决于基因的表达水平，同时与相关蛋白的修饰密切相关，如的泛素化[32]，的磷酸化和泛素化等[33-34]，其在茶树逆境响应过程中的功能机制有待进一步研究。

本研究系统分析了高温和干旱胁迫下茶树叶片中内源激素IAA、GA3、ZR、JA和ABA含量的动态变化，并基于转录组数据分析了各激素生物合成及信号转导相关基因表达水平变化，为进一步探究茶树依赖内源激素的高温和干旱胁迫响应分子机理提供了前期基础。然而，植物激素在各生命过程中并非单独发挥作用，各种激素之间既相辅相成，又相互制约[35]。因此，探究逆境胁迫下茶树内源激素间的协调关系，以及信号串扰机制具有重要意义，这也将是我们今后研究工作的重点方向。

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Changes of Endogenous Hormone Contents and Expression Analysis of Related Genes in Leaves of Tea Plants Under Heat and Drought Stresses

TANG Ziyi1, DU Yue1, YANG Hongbin1, LI Xinghui2, YU Youben1*, WANG Weidong1*

1. College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Extreme environments, such as heat and drought, seriously affect the growth and development of tea plants and the quality of tea production. Hormones are important signaling factors, but the molecular mechanisms of hormones involved in the response of tea plants to heat and drought stresses are rarely reported. In this study, we systematically analyzed the changes in endogenous hormone contents and the expression levels of related genes in leaves of tea plants under heat and drought stresses. The results show that the contents of IAA and GA3were significantly reduced and the contents of ZR were slightly increased in leaves of tea plants under heat and drought stresses, which were presumably used to delay the growth of tea plants to adapt to the environment stresses. Meanwhile, many genes related to biosynthesis and signal response of IAA, GA3and ZR were significantly differentially expressed, which provided a molecular basis for explaining the hormone content changes and signal transduction. In addition, the contents of ABA and JA increased significantly under both heat and drought stresses, which may depend on the up-regulated expressions of ABA biosynthetic pathway genes such as,,and JA biosynthetic pathway genes such as,,. Furthermore, many ABA signal responsive genes such as,and JA signal responsive genes such as,were also significantly differentially expressed, suggesting the important role of ABA and JA signaling pathways in the response of tea plants to heat and drought stresses. These results provided theoretical references for further exploring the molecular mechanisms of tea plants response to heat and drought stresses, which rely on endogenous hormones.

tea plant, endogenous hormone, ABA, JA, gene expression analysis, abiotic stress

S571.1

A

1000-369X(2023)04-489-12

2023-03-24

2023-07-13

陕西省重点研发计划项目（2022NY-154）、陕西省农业专项资金项目[NYKJ-2022-YL(XN)37]、国家茶叶产业技术体系（CARS-19）、西北农林科技大学科技推广重点项目（TGZX2022-2）

唐子贻，女，硕士研究生，主要从事茶树栽培育种及分子生物学研究。*通信作者：yyben@163.com；wangweidong@nwafu.edu.cn