基于网络药理学方法探讨地榆治疗结直肠癌的作用机制▲

缪涛声 黄梦芬 陈明榆 郑鸿铭 李逸婷 胡芝凡 莫乔兰 邱泽鑫 陈 斌

(1 广州中医药大学第一临床医学院,广东省广州市 510006;2 广州中医药大学第一附属医院脾胃科,广东省广州市 510405)

结直肠癌是全球第三大癌症,也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。我国2015年癌症中心数据显示,结直肠癌位于恶性肿瘤死亡谱第五位、发病谱第三位[2]。近年来,我国70岁以上人群的结直肠癌疾病负担明显增加,中国老年人群的结直肠癌防控形势严峻,需要采取相关措施以减轻其疾病负担[3]。结直肠癌的早期症状主要表现为腹痛、便血[4-5],在中医中证属“血证”中的下焦出血,在中医古籍中常被称为“下血”“痣血”等。如今中医药已被广泛应用于结直肠癌的治疗[6],从清热解毒、益气健脾、滋补肝肾等多角度提供新的治疗方案[7]。地榆记载于《神农本草经》,有凉血止血、解毒敛疮之效,主要用于治疗便血、痣血等,目前已有研究表明地榆的水提取物可通过阻滞Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路起到治疗结直肠癌的作用[8]。然而,关于地榆治疗结直肠癌的主要成分、作用靶点及其他的潜在调节机制尚未完全明确。网络药理学可通过预测中药所含化合物的靶点和药理作用,构建药物-基因-疾病网络,挖掘其可能的调节机制[9]。本研究基于网络药理学探索地榆治疗结直肠癌的作用机制,为地榆的临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 平台资料与软件 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/),药物靶标数据库(Therapeutic Target Database,TTD;http://db.idrblab.net/ttd/),OMIM®数据库(https://omim.org/),GeneCards®数据库(https://www.genecards.org/),STRING数据库(https://cn.string-db.org/),Metascape线上软件(https://metascape.org/),Cytoscape 3.7.2软件,GraphPad Prism 9软件。

1.2 研究方法

1.2.1 地榆有效活性成分的筛选及其作用靶点的预测:登录TCMSP数据库,以“地榆”为关键词,设置筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18,检索地榆的有效活性成分。再利用TCMSP数据库检索有效活性成分对应的作用靶点。最后在UniProt数据库中,将“Popular organisms”限定为“Human”,“Status”选择“Reviewed(Swiss-Prot)”,将相关靶点转化为标准基因名,并使用Cytoscape 3.7.2软件绘制“中药-成分-靶点”网络。

1.2.2 收集结直肠癌的相关靶点:以“Colorectal Cancer”为关键词,在TTD、OMIM®数据库和GeneCards®数据库检索结直肠癌相关靶点,将靶点导入Microsoft Excel表格汇总,删除重复靶点并进行标准化处理。

1.2.3 地榆有效活性成分作用靶点与结直肠癌相关靶点共同靶点的获取:将地榆有效活性成分的作用靶点与结直肠癌相关靶点取交集,即为地榆治疗结直肠癌的作用靶点,利用UniProt数据库将共同靶点名称转换为标准基因名,绘制韦恩图。

1.2.4 “中药-成分-靶点-疾病”网络和“中药-共同靶点-疾病”网络的构建与分析:将筛选得到的地榆有效活性成分及其作用靶点信息导入Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络,并分析地榆有效活性成分的度值。将共同靶点信息输入STRING数据库,蛋白种属设置为“Homo Sapiens”,得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络数据,再将数据导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理,得到PPI网络,即“中药-共同靶点-疾病”网络。

1.2.5 富集分析:针对共同靶点,采用Metascape线上软件进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,将蛋白种属设置为“Homo Sapiens”,其中GO通路包括生物学过程、细胞组分、分子功能。将数据进行可视化处理后得到气泡图。

2 结 果

2.1 地榆的有效活性成分及其作用靶点 利用TCMSP数据库检索到地榆有效活性成分共41个,根据筛选条件最终筛选得到有效活性成分13个。在TCMSP数据库中搜索上述13个成分的作用靶点(表1),因甜茶皂甙R1、3-O-没食子酰原花青素、棕儿茶素B-3、4,甲基-6-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖苷在TCMSP数据库中无相关作用靶点信息,为减少数据异质性,最终纳入地榆9个有效活性成分,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等。通过UniProt数据库将相关作用靶点转化为标准基因名并删除重复项后,最终得到154个地榆有效活性成分的作用靶点。构建“中药-成分-靶点”网络(图1),其中红色菱形节点为地榆的有效活性成分,节点越大代表度值越大,根据度值从大到小将成分按逆时针顺序排列,蓝色圆形节点为有效活性成分的作用靶点,外环是度值为0～1的靶点,中环是度值为2～3的靶点,内环是度值>3的靶点。

表1 地榆的有效活性成分信息

图1 “中药-成分-靶点”网络

2.2 结直肠癌相关靶点及地榆治疗结直肠癌的靶点 通过检索TTD数据库、OMIM®数据库、GeneCards®数据库,共筛选出结直肠癌相关靶点1 908个。将其与地榆有效活性成分的154个作用靶点取交集,共获得94个共同靶点,绘制韦恩图(图2),其中蓝紫色圆圈代表地榆有效活性成分的作用靶点,黄色圆圈为结直肠癌相关靶点,交集部分为地榆治疗结直肠癌的靶点。

图2 韦恩图

2.3 “中药-成分-靶点-疾病”网络 利用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络,直观展示地榆有效活性成分与结直肠癌靶点之间的关联程度与相互作用关系,见图3。图中橙色六边形节点代表地榆,黄色正方形节点代表结直肠癌,红色菱形节点代表地榆的有效活性成分,蓝色圆形节点代表共同靶点。通过Cytoscape 3.7.2软件对“中药-成分-靶点-疾病”网络进行分析,得到度值排名前3的有效活性成分为槲皮素、山柰酚与β-谷甾醇。

图3 “中药-成分-靶点-疾病”网络图

2.4 PPI网络 通过STRING数据库和Cytoscape 3.7.2软件构建地榆治疗结直肠癌的作用靶点的PPI网络(见图4)。在该PPI网络中,节点的颜色越深、越靠近中心、直径越大代表其度值越高,且同一圆圈上度值从大到小按逆时针顺序排列;每条边代表节点之间的关系,线条越多提示关联度越大。该PPI网络的平均度值为37,度值位于前20的靶点包括肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、苏氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase,AKT)1、Caspase-3、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)等(见图5),这些靶点可能是地榆治疗结直肠癌的关键作用靶点。

图4 PPI网络图

图5 PPI网络中度值位于前20的靶点

2.5 富集分析结果 采用Metascape网站对94个地榆治疗结直肠癌的作用靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。94个共同靶点共涉及1 387个生物学过程、55个细胞组分、116个分子功能,按-lgP值从小到大进行排序,选取排名前20的条目进行可视化分析,其中涉及的生物学过程主要有细胞群增殖的负调控、凋亡信号通路的调控、蛋白质磷酸化的正向调节等,涉及的细胞组分主要有膜筏、细胞外基质、内质网腔、染色体区域等,涉及的分子功能主要有激酶结合、蛋白激酶活性、内肽酶活性、核受体活性等。94个共同靶点共富集至173条通路,根据-lgP值大小筛选排名前20的主要通路,包括癌症信号通路、磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信号通路等。见图6。

图6 KEGG通路富集分析与GO功能富集分析结果图

3 讨 论

结直肠癌是常见的恶性肿瘤,其发病率逐年升高,已成为全球第三大高发癌症,是全球癌症死亡的主要原因之一[1]。近年来,随着生活习惯的改变,亚洲人群结直肠癌的发病率也越来越高[10],我国结直肠癌的发病率与病死率均呈上升趋势,是威胁我国人民健康的重要因素之一[11]。目前,结直肠癌的主要治疗方法有手术治疗、放疗、化疗等,但这些治疗方法存在治疗费用较高、副作用较大、患者依从性较差等缺点。中医药因其具有简便性、安全性等特点,已成为结直肠癌的治疗方法之一。朱月伊等[12]发现,四君子汤可通过降低程序性死亡受体1/程序性死亡配体1的表达,抑制自然杀伤细胞的活性与结肠癌细胞的增殖。还有研究显示,复方苦参注射液对结肠癌细胞的增殖具有抑制作用,并可诱导结肠癌细胞发生凋亡[13]。

地榆药性苦、酸、涩,微寒,有凉血止血、收敛止血、解毒敛疮之功效。《本草约言》中提到地榆“性沉寒,惟治下焦”,因此地榆常被用于治疗下焦出血。结直肠癌的主要症状为腹痛、便血,因此有医家提出采用中药治疗结直肠癌时可配伍地榆[14]。现代药理学研究表明地榆的水提取物可通过阻滞Wnt/β-catenin信号通路起到治疗结直肠癌的作用[8],但其潜在的作用机制尚未完全明确。本研究采用网络药理学方法对地榆治疗结直肠癌的有效活性成分及其作用机制进行研究,最终共筛选出9个地榆有效活性成分,其中度值排名前3的有效活性成分为槲皮素、山柰酚与β-谷甾醇。研究表明,槲皮素可通过调节转化生长因子-β1/Smad3蛋白信号通路,抑制下游8号染色体上的MYC的表达,从而抑制结肠癌LOVO细胞的生长[15]。在结直肠癌Kirsten大鼠中,肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)和B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(B-Raf proto-oncogene,serine/threonine kinase,BRAF)基因发生突变,槲皮素可同时作用于KRAS和BRAF,从而抑制结直肠癌细胞增殖,促进其凋亡[16]。山柰酚为黄酮醇类化合物,提高山柰酚的摄入量可以降低结肠癌、胃癌、胰腺癌的发生率[17-18]。有学者利用下一代测序等技术发现山柰酚可抑制结肠癌细胞增殖、转移和侵袭,同时促进结肠癌细胞发生凋亡和自噬[19]。

通过PPI网络分析得到地榆治疗结直肠癌的关键作用靶点,包括TP53、AKT1、TNF等。TP53基因是17号染色体上的抑癌基因,其编码的蛋白质在调节细胞周期、DNA修复和细胞凋亡方面,以及在癌症易感性及癌症的进展中发挥重要作用[20-21]。TP53基因突变可引起高频率的DNA损伤,造成微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI),促进癌症的发生[22]。TP53功能的丧失还可以促进肠道细胞的增殖,并使其细胞周期调节失控,这也是结直肠癌发生的核心机制[23]。有研究显示,TP53基因的突变与结直肠癌的发生显著相关[24]。Nakayama等[25]发现,TP53基因的突变可通过多种机制诱导核因子κB及癌症相关通路的激活,促进肠上皮-间质转化和炎症反应的发生,加速结直肠癌的进展,提示TP53功能缺失是结直肠癌发生的潜在危险因素之一。AKT1是PI3K信号通路的关键节点,PI3K/AKT信号通路可传递抗凋亡信号,并与癌细胞的生长、代谢及肠上皮-间质转化等密切相关[26]。有研究显示AKT1的过度活化可导致细胞增殖、分化及代谢等正常生理功能紊乱,而肿瘤细胞的过度增殖有助于其浸润和转移[27]。Agarwal等[26]的研究表明,结直肠癌小鼠中可伴随AKT1的活化及下游致癌信号通路的激活,抑制AKT1的磷酸化可能是抑制结直肠癌发生与发展的重要途径。TNF是参与核因子κB 信号通路的重要转录调节因子,核因子-κB信号通路广泛参与癌症的发生和发展,在结直肠癌细胞的增殖、凋亡、转移等过程中发挥着关键作用[28-29],因此TNF也是防治结直肠癌的重要靶点[29]。

本研究的GO功能富集分析结果显示,地榆治疗结直肠癌的作用靶点涉及的生物学过程主要有细胞群增殖的负调控、凋亡信号通路的调控、蛋白质磷酸化的正向调节等;涉及的细胞组分主要有细胞外基质、内质网腔、染色体区域等;涉及的分子功能主要有激酶结合、蛋白激酶活性、内肽酶活性、核受体活性等。肿瘤细胞迁移是肿瘤侵袭和转移的关键环节,膜筏、细胞外基质、染色体区域等皆是细胞信号传递的重要位点,其可能与结直肠癌的侵袭转移相关[30]。蛋白激酶活性、激酶结合与蛋白质的磷酸化密切相关,结合PPI网络分析与GO中的生物学过程分析,我们推测地榆可能通过调节TP53、AKT等蛋白的磷酸化,激活PI3K/AKT等信号通路,调控细胞增殖、分化、凋亡等,从而达到治疗结直肠癌的目的。

本研究的KEGG通路富集分析结果显示,地榆治疗结直肠癌涉及的通路主要有癌症信号通路、PI3K/AKT信号通路等。PI3K/AKT信号通路是结直肠癌发生与发展的关键通路。Duan等[31]发现,次黄苷单磷酸脱氢酶2可通过调节PI3K/AKT信号通路促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化。Jiang等[32]的研究表明,结直肠癌患者血清环状RNA IL4R水平较正常人升高且与结直肠癌的不良预后相关,进一步研究发现环状RNA IL4R可通过PI3K/AKT信号通路发挥促进结直肠癌发生与发展的作用。基于上述研究结果,有学者尝试通过调节PI3K/AKT信号通路治疗结直肠癌,如Wei等[33]发现肿瘤抑制因子同源物4可抑制PI3K/AKT信号通路,从而抑制结直肠癌细胞的上皮-间质转化并促使其发生自噬。本研究结果显示,地榆治疗结直肠癌的关键作用靶点AKT1、EGFR及IL-6等均是PI3K/AKT信号通路中的一部分,因此PI3K/AKT信号通路可能是地榆治疗结直肠癌的关键通路。有学者发现,地榆的有效活性成分之一槲皮素可以通过抑制PI3K/AKT信号通路来发挥抗癌作用[34-35]。Na等[36]发现,槲皮素在抑制PI3K/AKT磷酸化的同时可上调Caspase-3和B细胞淋巴瘤2相关X蛋白的表达,从而促进小鼠结肠癌细胞凋亡,进而发挥治疗结肠癌的作用。

综上所述,地榆中的多种有效活性成分可能通过TP53、AKT1、TNF、EGFR、IL-6等靶点来作用于膜筏、细胞外基质、内质网腔、染色体区域等细胞组分,实现蛋白质的磷酸化、细胞增殖及凋亡等分子功能,以及调节PI3K/AKT信号通路等生物过程,从而发挥治疗结直肠癌的作用。本研究基于网络药理学方法对地榆治疗结直肠癌的潜在机制进行研究,预测地榆治疗结直肠癌的可能作用通路,为地榆治疗结直肠癌的实验研究提供了方向。